Summary
Samenvatting - Advanced labtools (Life Science)
- Course
- Institution
Samenvatting - Advanced labtools (Life Science) Aan de Hogeschool Utrecht
[Show more]
Seller
Follow
laralommers
Content preview
Leerdocument AdvancedLabtools
Contents
Les 1+2: Biochemical techniques............................................................................................................1
Les 3: Next generation sequencing (Short read).....................................................................................9
Les 4: Next generation sequencing (long read)....................................................................................14
Les 5: Cell health assays........................................................................................................................19
Les 6: Flowcytometrie...........................................................................................................................24
Les 7: proteomics I................................................................................................................................28
Les 8: proteomics II...............................................................................................................................32
Les 9: imaging.......................................................................................................................................35
Les 1+2: Biochemical techniques
De functionele componenten van eiwitzuiveringsbuffers en hun toepassing beschrijven
afhankelijk van het type uitgangsmateriaal en de doelstelling, uitleggen welke buffercomponenten,
disruptiemethoden en fractioneringsmethoden belangrijk zijn bij de lysis, homogenisatie en
fractionering van het materiaal.
Disruptie van het weefsel kan met niet-mechanische en mechanische methoden bewerkstelligd
worden. Het type startmateriaal heeft invloed op de te kiezen methode. Celsuspensies uit een
celkweek kunnen op een heel zachte manier behandeld worden, terwijl stukjes weefsel al
moeilijker zijn om te homogeniseren. Bij bacteriën en plantencellen hebben we weer te maken
met celwanden, waardoor grovere mechanische methoden of een enzymatische aanpak nodig is.
Een osmotische shock kan verkregen worden door cellen eest in een hypertone oplossing te
brengen, met hoge osmolariteit (bijvoorbeeld dmv hoog percentage van sucrose). Door
vervolgens naar een hypotone oplossing te gaan, kunnen de cellen openbarsten. Het toepassen
van vries-dooi cycli kan ook een methode zijn om intracellulair materiaal uit de cel te laten lekken
doordat de celwand en membraan kapot gaan door de vorming van ijskristallen. Cellen met
celwanden kunnen behandeld worden met lytische enzymen waardoor de celwanden kapot gaan.
Vervolgens kan osmotische shock of lichte mechanische behandeling de cellen open laten
barsten.
Er zijn verschillende mechanische methoden om celdisruptie te veroorzaken. Punt van aandacht is
dat deze eigenlijk allemaal warmte veroorzaken. En warmte kan eiwitten denatureren. Belangrijk
om de apparatuur, homogenisatiebuffer en uitgangsmateriaal goed te koelen! Homogeniseren
kun je het beste in korte stapjes doen waarbij het homogenaat tussendoor steeds goed gekoeld
wordt.
Mixers en blenders. Rotor door dat ding aan te zetten en ondergedompeld te houden in gekoelde
homogenisatie buffer, zal weefselmateriaal erin gezogen worden en door de slotjes naar buiten
gedrukt worden, daarbij wordt het weefsel kapot gemaakt en gemengd. Wanneer een cytoplasma
,eiwit geïsoleerd dient te worden, is het intact houden van de organellen structuur minder
noodzakelijk en kan voor een van deze disruptiemethoden gekozen worden.
Sonicators zorgen via een metalen probe voor utrasone golven die cellen kapot kunnen maken.
Een ultrasoon waterbad zorgt voor een iets zachtere methode van celdisruptie.
Homogenisers veroorzaken d.m.v. heen en weer bewegingen van een glazen of teflon stamper (of
pestle) dat cellen tegen de zijkant van de wand van de buis gedwongen worden en daardoor door
shearing stress kapot gaan en hun inhoud vrijgeven. De opening tussen de pestle en de buis kan
variëren in grootte 0,05 tot halve mm zijn en kies je, afhankelijk van de toepassing. Handig bij
isoleren van intacte organellen.
Als een enzym vrijkomt uit het intracellulaire milieu, wordt het blootgesteld aan allerlei factoren
die kunnen zorgen voor denaturatie of inactivatie. Daarom is het heel belangrijk om tijdens
homogenisatie, maar ook in andere purificatie stappen buffers te gebruiken die reagentia
bevatten die mogelijke schadelijke effecten te niet doen.
Fractionering mbv centriugatie kan op een simpele
standaardmanier door pellet en supernatant van elkaar
te scheiden. Verfijningen van deze methode zijn het
zogenaamde stapsgewijs pelleteren, en het toepassen
van een gradiënt om op basis van dichtheid organellen
of moleculen te scheiden. Met stapsgewijs peleteren is
het mogelijk om specifieke organellen te isoleren. Het
principe van deze techniek is het pelleteren van
opeenvolgende supernatanten bij steeds hogere
snelheden. Bij steeds hogere snelheden zullen steeds
kleinere componenten pelleteren. Gradient
centrifugeren is te zien in het figuur hier naast (links
lage gradient en rechts hoge gradient). Ultracentrifuge:
Vaak wordt dan heel lang afgedraaid, tot wel drie
dagen lang. Hiermee kunnen heel kleine organellen of
macromoleculen gefractioneerd worden. Vacuum
wordt toegepast om de mate van frictie die optreedt bij hoge snelheden te verminderen.
Verschillende rotoren (hieronder) Die laatste is heel erg geschikt bij toepassingen waar
componenten op dichtheid gescheiden worden via een gradiënt.
,De specifieke activiteit, zuiveringsfactor (purification factor) en opbrengst (yield) van eiwitten
uitrekenen.
Zuiverheid = specifieke activiteit na de stap/oorspronkelijke specifieke activiteit
De specifieke activiteit is de enzymactiviteit gecorrigeerd voor totale hoeveelheid eiwit
(units/mg). Door bij elke stap de specifieke activiteit te bepalen kan iets gezegd worden over de
mate van zuivering bij elke stap, de purification factor.
Opbrengst = totale activiteit na de stap/oorspronkelijke totale activiteit
De opbrengst, of yield is het percentage van de hoeveelheid enzyme, of enzymactiviteit die nog
over is na een bepaalde stap.
De principes van alle behandelde eiwitzuiveringstechnieken (dialyse, uitzouten, verschillende
kolom chromatografie technieken) uitleggen.
Als je dan de eerste centrifugestappen hebt uitgevoerd wil je ook zoveel mogelijk niet-eiwit
componenten kwijt zien te raken. Membranen en lipiden kun je met detergentia kwijt proberen te
raken, terwijl nucleïnezuren weer heel makkelijk met
behulp van DNAses en RNAses verwijderd kunnen
worden.
Dialyse: Het sample dat je wilt zuiveren breng je in
een zakje dat bestaat uit een semi-permeabel
membraan en dat hang je weer in een bekerglas met
gewenste buffer. Dat membraan heeft een bepaalde
poriegrootte. Dialyse is niet geschikt voor kleine
eiwitten.
Ultrafiltratie: Ultrafiltratie is een membraanfiltratiemethode waarbij krachten zoals druk- of
concentratiegradiënten leiden tot een scheiding door een semipermeabel membraan. Stoffen met
een hoger molecuulgewicht worden vastgehouden in het zogenaamde retentaat, ze komen niet
door het filter, terwijl water en stoffen met een laag molecuulgewicht door het membraan in het
zogenaamde permeaat (filtraat) terecht komen.
, Uitzouten: kan helpen om zowel het monstervolume te verkleinen als ook een beperkte mate van
zuivering van het eiwit te verkrijgen. Precipitatie hangt af van het bestaan van hydrofobe
‘patches’ op het oppervlak van eiwitten, wat leidt tot een reorganisatie van watermoleculen in
hun omgeving. Wanneer ammoniumsulfaat aan het extract wordt toegevoegd, lost dit zout op en
ontstaan ionen die gehydrateerd worden. Hierdoor blijven er minder watermoleculen over om te
associëren met het eiwit. Als gevolg hiervan worden de hydrofobe plekken als het ware
blootgesteld en kunnen hydrofobe interacties tussen verschillende eiwitmoleculen resulteren in
eiwitaggregatie, samenklonteren. Dit zorgt voor neerslag/precipitatie. De basis van fractionering
bij deze methode is dat, naarmate de zoutconcentratie van het extract wordt verhoogd, eiwitten
met grotere of een hoger aantal hydrofobe patches zullen neerslaan voordat eiwitten met
kleinere of minder hydrofobe patches neerslaan. De oplosbaarheid wordt bij het verhogen van de
zoutconcentratie in eerste instantie juist hoger. Het heeft te maken met het feit dat positieve
ionen op plekken met negatieve lading in het eiwit gaan vertoeven en negatieve ionen op de
positieve groepen van het eiwit.
Kolom chromatografie: De scheidingsmethode berust op het feit dat verschillende moleculen
verschillend hechten aan de zogenaamde stationaire fase, de kolom. Hierdoor gaat het ene
molecuul sneller door de kolom heen dan het andere molecuul. Gelfiltratie, ion exchange (kation
negatief, anion positief), affiniteits chromatografie (hoge resolutie), immuno affiniteit.
Ion exchange: Een eiwit met een hoge pI zal bij een neutrale pH positief geladen zijn en sterk
binden aan een kationenwisselaar bijvoorbeeld. Dit terwijl eiwitten met een lage pI dan juist snel
elueren. Door nu de zoutconcentratie van de buffer geleidelijk te verhogen zullen door
ionenuitwisseling, de gebonden eiwitten op verschillende momenten elueren en kunnen deze
gefractioneerd worden.
Metaal affiniteit: Een veel gebruikte toepassing is de affiniteit van histidine aminozuren voor
nikkel. Eiwitten kunnen gefuseerd worden met een tag van aan elkaar gekoppelde histidine
aminozuren. Deze his-tagged eiwitten kunnen dan opgezuiverd worden via een nikkel-kolom.
Onder condities van een pH boven de 7, zullen histidine residuen metaalionen als nikkel cheleren
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller laralommers. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.54. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
66579 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now