Dit zijn mijn aantekeningen van de bespreking van het volgende artikel:
"Abrogating Native α-Synuclein Tetramers in Mice Causes a L-DOPA-Responsive Motor Syndrome Closely Resembling Parkinson's Disease"
Ik heb per afbeelding kort opgeschreven wat er weergegeven staat.
Primair artikel 7, Parkinson
Eerst 7/8 minuten gemist met belangrijke opmerkingen dus ff terugluisteren
Introductie
Gekeken hoe a sucleine aggregeert als het
niet meer in tetrameren voorkomt en hoe
dat de muizen beïnvloed. Ze hebben de
monomeren tot stand gekregen door
mutaties in een bepaald motief in het gen.
Ze kunnen 1 keer E→K mutatie doen of 3
keer.
Een monomeer kan met een alpha helix
voorkomen of ongestrucuteerd waardoor
het oligomeren en fibrillen met beta sheets
kan vormen.
Figuur 1
A. Deze western blot toont meerdere vormen van alpaS. Bij de 3K mutant zie je een toename in
de monomeren en een afname in de mono- en multimeren.
B. Kwantificatie van A. Bij een enkele mutant is de T:M ratio al lager dan WT, maar bij de 3K is
de ratio nog lager.
Deze experiment zijn in neuroblastoma cellen gedaan. Dit zijn voorlopers van neuronen en in dit
geval kankercellen. Ze hebben alphaS ingebracht middels transfectie (plasmide construct). Je wilt
eerst in een cellijn testen of hetgeen wat jij verwacht wel echt gebuert, anders is het zonde om
dieren te gaan gebruiken.
C. Bax is co-apoptotisch eiwit dus positieve controle. Je ziet dus meer apoptose bij de 3K
mutant.
D. Kwantificatie
E. Confluent zit alles aan elkaar vast en heb je geen open ruimtes. Dus is een maat voor de
celdeling en hoe snel dit gaat. Zo zie je minder celdeling bij de 3K mutant dan bij WT en de
enkele mutanten.
Verder wordt LDH afgegeven bij schade aan het plasmamembraan dus meer schade bij 3K
F. Hoe meer mutaties er zijn hoe toxischer het is → meer monomeren zijn toxisch.
Figuur 2
Vanaf nu in echte muizen gekeken met de mutaties
A. Overzicht van de mutaties. Je kan 1 mutatie hebben in een van de 3 of je kan ze alle drie
doen. Ze hebben van de 1K mutaties gevonden uit fPD gevallen en zijn zo op de rest
gekomen. Verder zie je nog syn1, 4B12 etc. aangegeven. Dat zijn epitopen van antilichamen
tegen alphaS.
B. Hetzelfde als figuur 1A eigenlijk, maar dan dus in muizen. Je ziet ook hier meer monomeren
voor de 3K mutant dan de enkele mutant. Normaal stop je eigenlijk SDS bij je gel zodat je
eiwitten loskomen van elkaar en enkel losse eiwitten te zien zijn. Hier hebben ze eerst
crosslinking gedaan, waardoor covalente verbindingen ontstaan en daarna is pas de gel
gedaan dus dan blijven ze wel aan elkaar. DJ-1 is een controle voor equal crosslinking en
actine is een loading controle. Je ziet twee bandjes bij DJ-1 dus je hebt monomeren en
gecrosslinkte eiwitten → de crosslinking is gelukt.
C. T:M ratio verlaagd als je meer mutaties hebt.
D. Om te kijken of verschil in ratio niet komt door meer of minder alphaS is een ELISA gedaan en
je hebt dus overal evenveel alphaS.
, E. Immunostaining gedaan voor alphaS en dan zie je geen verschil in WT, 1K en 3K.
F. Bij 3K heb je een verminderd aantal tetra- en multimeren in alle hersengebieden die relevant
zijn voor motorfunctie en daarbij heeft 3K meer monomeren. Bij NTG zie je geen bandjes
voor alphaS doordat hier een antilichaam is gebruikt dat vooral humaan alphaS herkent en
geen muis alphaS.
Str staat voor striatum, Ni staat voor substantia nigra en Cx voor (motor)cortex. PD patiënten
hebben minder dopaminerge neuronen in de Ni en deze projecteren naar het Str dus het is
logisch om hier naar te kijken.
G. T:M ratio is veel lager in 3K muizen dan WT muizen in alle drie de hersengebieden.
Je ziet meer tetrameren in de Wt bij Ni en Cx, maar niet significant in Str.
Je ziet significant meer monomeren in alle drie de hersengebieden.
H. TBS, geeft de oplosbare fractie van het cytosol aan. Bij WT zie je heel veel in het cytosol
opgelost en ook aardig wat bij 3K. Bovenste is 15G7 antilichaam en middelste is C20
antilichaam wat ook muis alphaS aantoont en cleaved alphaS kan binden waarbij de C-
terminus is afgeknipt. Bij Parkinson wordt vaak gevonden dat de C-terminus afgeknipt is, dat
zien ze vaak in lewy bodies (je ziet ook vaak gefosforileerd alphaS in PD patiënten). Je ziet
deze gekliefde vorm dus al in 3K muizen verschijnen.
TX, geeft de oplosbare fractie aan het membraan aan. Hier lijkt meer voor 3K te zijn dan voor
WT.
TX-insol, geeft de niet-oplosbare fractie aan het membraan aan. Dit is waarschijnlijk de
aggregaat vorm die als fibrillen met betasheets voorkomt. Hier zie je echt een groot verschil
tussen 3K en WT.
Van links naar rechts dus steeds agressievere buffers gebruikt.
I. Kwantificatie van H. In TBS zie je al wat gekliefd alphaS, maar bij de andere fracties zie het
nog meer.
Figuur 3
Ze hebben gekeken naar de gedragsveranderingen van de mutanten.
A. Ze hebben middels imaging stacking de tremor (trilling) van de muis waargenomen. Deze is
gekwantificeerd in D waarbij je ziet dat de tremor significant verhoogd is in 3K muizen
vergelijken met WT muizen. Dit fenotype komt overeen met fPD. De contour sharpness is
een andere manier voor het aangeven van de trilling. Hoe minder scherp de contour is, hoe
meer de muis trilt. De vaagheid van de foto kwantificeert dus de trilling van de muis.
B. Hier hebben ze naar clasping (samentrekken) van de achterpoten gekeken en dat zie je veel
meer bij de 3K muizen naarmate ze ouder worden. WT doet dit niet en deze gedragsproef
toont dus aan dat de motorcapaciteit van 3K steeds minder wordt. Dit is gekwantificeerd in
D.
C. Paalklim beeld.
D. Kwantificatie
E. Hier hebben ze naar open field (OF) gedrag gekeken en dan zie je dat de SK muizen bij 6
maanden oud significant minder verplaatsen dan WT. Dit zie je zowel in verticale als
horizontale richting. Bij 3 maanden zie je al wel een trend, maar geen significant verschil.
Verder vallen de 3K muizen sneller van een draaiende stok af (rotarod) en doen ze er langer
over om naar beneden te klimmen van een verticale paal. Daarbij vallen ze er ook vaker
vanaf. Motorisch gezien kunnen 3 K muizen dus minder goed moeilijke taken voltooien.
Figuur 4
A. Immunostaining gedaan in 3 verschillende hersengebieden. Met 15G7 is de volledige lengte
alphaS aangetoond (epitoop C terminus). In het midbrain en de cortex zie je veel heftigere
staining hiervan.
B. Hier hebben ze naast 15G7 staining ook proteinase K resistentie getest (laatste ook gebruikt
in practicum om weefsel embryo’s kapot te knippen). Je ziet dan bij 3K nog steeds staining
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller brittheijmans. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.21. You're not tied to anything after your purchase.
