Summary
Samenvatting microscopie
- Course
- Institution
Heel gedetailleerde samenvatting van de powerpoint en aantekeningen. Ook eigen notities toegevoegd om het duidelijker te maken.
[Show more]
Seller
Follow
emmavandooren1
Content preview
H5 – Microscopie2.1 Fluorescentiemicroscopie
Fluorescentie gebaseerd op absorptie van licht bij een bepaalde golflengte, die meestal
binnen het UV-bereik ligt.
Eenmaal het licht is geabsorbeerd, zal ook een emissie van licht gebeuren met een langere
golflengte = stokes shift
Veronderstel dat dit de energieniveaus zijn van de fluorescente
moleculen
• als moleculen fluorescent licht met bepaalde golflengte
gaan absorberen = excitatielicht → gaat van grondtoestand
naar de aangeslagen toestand gaan
• in aangeslagen toestand = klein deel verlies van energie
• fluorescente molecule valt terug naar grondtoestand
waarbij licht wordt uitgestuurd = fluorescentielicht
Maar niet elk licht kan deze fluorescente moleculen gaan exciteren → daarvoor specifieke
golflengte nodig = beschreven door excitatiespectrum
Elk fluorescente molecule heeft excitatiespectrum waarbij hoogte overeenkomt met
waarschijnlijkheid dat licht met die specifieke golflengte die fluorescente molecule
kan gaan exciteren
In dit geval: licht met golflengte van 475 nm = meeste kans om fluorescente molecule te
exciteren
1 keer dat die fluorescente molecule is geëxciteerd → zal die fluorescente molecule zeer
snel fluorescent licht uitsturen (snel naar grondtoestand) maar ook hier gaat de golflengte
van uitgestuurde fluorescent licht gekoppeld worden aan spectrum = emissiespectrum
Ook hier komt hoogte van spectrum overeen met waarschijnlijkheid dat licht met
die golflengte wordt uitgestuurd
In dit geval: licht met golflengte van 525 nm = meeste kans dat fluorescente molecule licht
met die golflengte zal uitsturen
We hebben 2 lichtbundels = excitatiebundel & emissiebundel
, EXAMEN: Als fluorescent licht niet zo intens is, hoe maak je het intenser? Intensiteit van excitatielicht
verhogen → # fluorescentiemicroscopie
2.5.1 fotonen in bundel verhogen → veel meer pakketjes van energie die kunnen exciteren
Niet energie veranderen, wel de intensiteit Me
Fluorescentie
→ we kunnen gaan spelen met deze 2 bundels
Absorptie
We van licht bij bepaalde golflengte (meestal in UV bereik) en emissie van licht met een langere golflengte (Stokes shi
kunnen….
- specifieke golflengte gebruiken als excitatielicht zodat we zeer gericht een bepaalde
=> specifieke moleculen visualiseren door autofluorescentie of door specifieke fluoroforen of fluorescente proteines te koppel
fluorescente
aan deze molecule
moleculen (Alexa, Greenkunnen gaan
Fluorescent exciteren & andere fluorescente moleculen niet
Protein)
gaan exciteren → zeer specifiek signaal = specifieke kleur
2.5. Microscopie
- verschillende golflengtes gebruiken om verschillende fluorescente moleculen te
4. BASISTECHNIEKEN
gaan exciteren → daarna het fluorescent licht, dat verschillende golflengtes heeft,
filteren & zo een specifieke golflengte daaruit gaan selecteren
werken met verschillende kleuren door een juiste combinatie van filters
bv. fibroblast: celkern, mitochondriën & cytoskelet → je ziet dat we door combinatie van
kleuren die verschillende structuren tegelijk in beeld kunnen brengen
verschillende kleuren combineren door juiste combinatie van filters
fibroblast
celkern: blauw
mitochondria:
cytoskelet: gro
intenser
Sterkte van laserlicht => beter
fluorescent signaal
signaal <> bleachingfluorescente licht → afhankelijk van intensiteit
= intensiteit
van excitatielicht
hoe intenser excitatielicht, hoe meer fluorescente moleculen zullen worden
geëxciteerd, hoe meer fluorescent licht zal worden uitgezonden
hoe intenser excitatielicht, hoe beter signaal
MAAR rekening houden met bepaalde effecten die kunnen optreden: bleaching = na
herhaaldelijke blootstelling aan excitatielicht, zal fluorescente moleculen zijn fluorescente
eigenschappen verliezen → je kan niet ∞ keer een fluorescente molecule gaan exciteren
want na tijdje gaat hij zijn vermogen om geëxciteerd te worden verliezen → geen
fluorescent licht meer uitsturen = fluorescentie gaat geleidelijk aan uitdoven
Zie foto: beeldjes opgenomen na herhaaldelijke excitatie van dit staal → je ziet dat blauwe
fluorescente moleculen geleidelijk aan hun fluorescente eigenschappen gaan verliezen
Sommige moleculen zijn gevoeliger voor bleaching dan anderen → zeker
rekening houden met welk type fluorescente moleculen je aan het werken bent
Als er een grote kans is op bleaching voor specifiek molecule → zeer voorzichtig
zijn met excitatiesignaal & moet je slim gaan omspringen met hoeveelheid
excitatielicht om te voorkomen dat te snel je fluorescent signaal gaat kwijtspelen
Inleiding
Lichtmicroscopie = licht schijnen doorheen staal om staal te kunnen gaan bestuderen
Verschillende contrasttechnieken mogelijk bv. fase-contrast of DIC
Anderzijds kunnen we ook fluorescentie gaan gebruiken om contrast te generen bij
microscopie
, Verschil:
- Lichtmicroscopie = maar 1 lichtbundel → licht dat we stuurden doorheen ons staal
(transmissie microscopie)
- Fluorescentiemicroscopie = 2 lichtbundels
• Excitatielicht waarmee we onze fluorescente moleculen in staal gaan exciteren =
excitatielicht nodig om contrast te genereren
• Emissielicht = fluorescent licht dat fluorescente moleculen uitsturen
Hoe werkt fluorescentiemicroscopie?
Schematische voorstelling fluorescentiemicroscoop:
detector
• Lichtbron = polychromatische lichtbron
= verschillende golflengtes aanwezig in lichtbron
Biedt grotere flexibiliteit naar het exciteren van
oculair emissiefilter verschillende fluorescente moleculen omdat we
verschillende golflengtes kunnen gebruiken
Kan ook zijn dat we monochromatische lichtbron
Kleur
selectieve gaan gebruiken bv. laser, die maar 1 specifieke
spiegel
golflengte gaat uitsturen
Flexibiliteit naar het exciteren van fluorescente
lichtbron
moleculen met verschillende golflengte eerder
excitatiefilter beperkt (moeten dan verschillende lasers gaan
objectief gebruiken)
• Excitatiefilter = specifieke golflengte selecteren
Stel blauw licht nodig om fluorescente moleculen te
gaan exciteren → excitatiefilter die enkel blauw licht
specimen gaat doorlaten
Geselecteerde golflengte valt in op kleur selectieve spiegel bv. blauw licht
• Kleur selectieve spiegel = spiegel die enkel licht met een bepaalde golflengte zal
weerspiegelen & ander licht met andere golflengte gaat doorlaten
Kleur selectieve spiegel gaat blauw licht weerkaatsen zodanig dat het op het specimen
wordt geprojecteerd, nadat het door het objectief is gegaan
• Specimen = fluorescente moleculen op specimen worden geëxciteerd door blauw licht
(enkel fluorescente moleculen die gevoelig zijn voor dit blauw licht) → fluorescente
moleculen sturen fluorescent licht uit met langere golflengte & lagere energie = groen
licht
Emissielicht gaat hetzelfde pad afleggen en gaat dus ook door hetzelfde objectief → gaat
door kleur selectieve spiegel worden DOORGELATEN omdat het een andere golflengte heeft
dan excitatielicht = stoke shift
Vandaar dat die stoke shift belangrijk is!!!
, Emissielicht gaat door emissiefilter passeren
• Emissiefilter = wordt gebruikt…
- als je bij blauw licht ook nog andere kleuren gaat exciteren → kleuren kunnen hier
ook worden tegengehouden zodanig dat we enkel maar naar groene licht gaan kijken
- voor achtergrondlicht → als we strooilicht hebben dat invalt op spiegel of
preparaat, kan dit ook tegengehouden worden door emissiefilter
Onderdrukking achtergrondlicht → beter signaal
Uiteindelijk gaan we enkel maar het groene licht laten invallen op het oculair & de detector
Voordelen:
- zeer handige techniek → je moet er enkel voor zorgen dat er fluorescente moleculen
aanwezig zijn in specimen die specifieke info kunnen leveren & in dit geval gevoelig
zijn voor blauw licht
- zorgt voor goed contrast
Nadelen:
- microscoop is scherp gesteld op focale vlak
Dus eigenlijk willen we enkel maar contrast uit dit focale vlak → zodanig dat we ons
specimen doorheen dit focale vlak zeer goed in beeld kunnen brengen
MAAR bij epi-fluorescentie/ breedveld microscopie wordt ons volledige specimen
overspoeld met excitatielicht (nadeel van opstelling) → overal waar het blauwe licht kan
geraken worden fluorescente moleculen geëxciteerd → gaan signalen afgeven niet enkel in
focale vlak maar ook boven en onder focaal vlak
Resultaat: je gaat focale vlak niet meer zo heel scherp zien (minder contrast + resolutie)
omdat we ook veel achtergrondfluorescentie krijgen van boven en onder het focale vlak
Oplossing 1: we willen optische coupes maken = in feite enkel maar fluorescent signaal gaan
krijgen van specifieke snede doorheen specimen ≈ effectief coupes maken
Voordeel:
- referentietechniek omdat het zorgt voor de hoogste resolutie & hoogste sensitiviteit
Nadeel:
- technisch moeilijker uit te voeren
- tijdsrovend
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller emmavandooren1. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.67. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
53068 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now