Het betreft een samenvatting van de bundel Theorie technieken uit Proteinlab van het vak biochemie. Het wordt gegeven in het tweede leerjaar in periode 2.3 van de opleiding Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek. Het gaat om de zuivering van eiwitten met verschillende zuiveringsprocessen. Het be...
Biochemie
Theorie technieken uit ProteinLab
Strategie
Eerste overwegingen
Een prokaryoot, eukaryoot en een cel bevatten tienduizenden verschillende eiwitten met
verschillende biologische activiteiten. De zuivering van individuele eiwitten kan daarom belangrijk
zijn voor de structuur en functie. Door de juiste procedures te selecteren en deze zorgvuldig met
opeenvolgende stappen toe te passen, is het mogelijk om een hoge mate van zuivering van het
gewenste eiwit te verkrijgen. Door de structurele en functionele verschillen tussen eiwitten, is het
mogelijk deze te zuiveren.
De meeste eiwitten zijn vrij fragiele moleculen. De blootstelling aan gematigde temperaturen
(bijvoorbeeld 37 graden Celsius) veroorzaakt een langzame denaturatie, hierdoor worden alle
zuiveringsstappen bij lage temperaturen (0-4 graden Celsius) uitgevoerd. Eiwitten zijn gevoelig voor
extreme nh-extremen, zodat zuivering procedures uitgevoerd worden in gebufferde oplossingen en
pH-extremen worden vermeden. Veel eiwitten zijn in een verdunde oplossing instabieler.
Isolatie van het eiwit in oplosbare vorm
Het uitgangspunt voor eiwitzuivering is een cultuur van bacteriële, plantaardige of dierlijke cellen of
een bepaald dierlijk weefsel of orgaan. Eerst moeten de eiwitten uit de cellen verwijderd worden,
zonder het verlies van biologische activiteit. Vaak door middel van homogenisatie als het uit dierlijke
cellen is. Bacteriën, gisten en plantencellen hebben dikke celwanden die het gebruik van meer
storende procedures vereisen, zoals sonicatie (sonische straling) of het gebruik van een
hogedrukpers.
Keuze van zuiveringsmethoden
Het optimale zuiveringsschema voor een bepaald eiwit hangt af van de structurele en functionele
eigenschappen van het gewenste eiwit en van de eiwitverontreinigingen waaruit het gezuiverd moet
worden.
1. De eerste stappen zijn meestal die welke het laagste oplossende vermogen hebben, zoals
ammoniumneerslag of voor sommige eiwitten, warmte denaturatie. Het voordeel hieraan is
dat de totale hoeveelheid eiwit in het monster sterk wordt verminderd, zodat
chromatografische procedures, in staat zijn tot een hoge resolutie. Procedures met een zeer
hoge resolutie, maar met een lage capaciteit, zoals iso-elektrische focusering, worden vaak
pas later in een zuiveringssystemen toegepast als de totale hoeveelheid eiwit relatief klein is
en vervuilende eiwitten in vrij lage concentraties aanwezig zijn.
2. Het is efficiënter om een reeks methoden te kiezen die verschillende fysieke of functionele
eigenschappen van de eiwitten benutten in plaats van een reeks stappen die dezelfde
eigenschap benutten. De kolomchromatografie bevatten meestal ten minste een
groottefractionatieprocedure (gelfiltratie) en minstens een ladingsfractionatiestap (ionen-
uitwisselingschromatografie).
3. Bij de chromatografie is het gebruikelijk om opbrengst op te offeren voor meer zuiverheid.
4. Sommige eiwitfractionatietechnieken, met name SDS-polyacrylamidegelelektroforese, iso-
elektrische focusering en tweedimensionale gelelektroforese, worden niet gebruikt als
voorbereidingsprocedures voor eiwitzuivering, maar worden gebruikt om de voortgang van
de zuivering te controleren. Het is een analytische techniek met hoge resolutie. Soms kunnen
deze technieken voldoende eiwitten opleveren voor onderzoeksdoeleinden.
5. Sommige technieken zijn relatief goedkoop en snel, zoals warmtebehandeling of
ammoniumsulfaatfractionatie, terwijl andere duur en tijdrovend zijn.
, Toezicht op de zuivering
Als het eiwit een hormoon is, kan een hormoon-bindende test, radioimmunoassay of bioassay
gebruikt worden. Bij de zuiveringen worden fracties gemaakt. Hiervan wordt de hoeveelheid van het
gewenste eiwit gemeten. Die noodzakelijk is voor de totale hoeveelheid eiwit die aanwezig is in die
fractie.
Kwantitatieve van totaal eiwit
De lichtabsorptie van het eiwitgehalte kan gemeten worden bij 280 nm. Het is een gewoonte om de
fractionering van de totale eiwitten door kolomchromatografie te controleren met behulp van een
continue-flow in een spectrofotometer die gekoppeld worden aan de grafiek recorder.
Een alternatieve benadering van een directe spectrofotometrische schatting van eiwitgehalte is het
totale eiwitgehalte van elke fractie met behulp van een chemische test, zoals de Lowry-procedure of
de kleurstofbinende tests zoals de Bradford-procedure.
Test van enzymatische activiteit
De hoeveelheid enzym is een oplossing die bepaald kan worden door de katalytische activiteit te
meten d.w.z. de hoeveelheid verbruikt substraat of het product dat in de tijd van de eenheid wordt
geproduceerd. Een enzym moet opgenomen worden in een reactiemengsel waarbij de pH optimaal is
voor het enzym en alle benodigde cofactor of co-enzymen, het substraat, aanwezig zijn die nodig zijn
om het enzym te verzadigen.
Om de reactiesnelheid te controleren, is een eenvoudige, specifieke analysemethode nodig voor het
meten van het verbruik van het substraat of het uiterlijk van de producten. Het substraat is meestal
aanwezig bij een vrij hoge concentratie om verzadiging van het enzym te garanderen, is het
nauwkeuriger om de voortgang van de enzymreactie te controleren door veranderingen in de
productconcentratie te meten in plaats van de substraat concentratie. Als het enzym dat gezuiverd
wordt een reactie katalyseert waarbij geen enkel substraat of product spectrofotometrisch gevonden
kan worden. Het kan mogelijk zijn om een tweede reactie te gebruiken om een van de producten om
te zetten in een verbinding die licht absorbeert en gemeten kan worden. Het is een gekoppelde test
genoemd.
Specifieke activiteit, verrijking en opbrengst
Een specifieke activiteit is een maat voor de enzymzuiverheid. De absolute waarde van specifieke
activiteit is niet belangrijk bij een enzymzuivering, omdat die afhangen van de intrinsieke katalytische
vermogen van het specifieke enzym dat bestudeerd wordt.
Verrijking = (specifieke activiteit van fractie)/(oorspronkelijke specifieke activiteit).
Het enzym moet ook een goede opbrengst terug winnen.
Opbrengst = 100* (enzymeenheden na zuiveringsstap) / ()/ (enzymeenheden in oorspronkelijke
preparaat).
Beoordeling van de zuiverheid
Als het eiwit zuiver is kan het alleen verkregen worden door eiwit sequencing. Hiervoor kunnen
eenvoudige analytische procedures gebruikt worden om een goede indicatie te geven van de
zuiverheidsgraad. Meestal wordt hiervan een SDS-PAGE gebruikt worden, die gevoelig is en
polypeptiden uitsluitend scheidt op basis van de grootte. Een alternatief is de iso-elektrische
focusering omdat deze scheidt door lading verschillen. Het kan ook door een tweedimensionale
gelelektroforese die eiwitten scheidt door de lading in de eerste dimensie (iso-elektrische focusering)
en grootte in de tweede dimensie (SDS-PAGE).
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller Niempje21. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.75. You're not tied to anything after your purchase.
