100% satisfaction guarantee Immediately available after payment Both online and in PDF No strings attached
logo-home
samenvatting methoden 3: bmw3 KUL $8.09
Add to cart

Summary

samenvatting methoden 3: bmw3 KUL

 18 views  0 purchase
  • Course
  • Institution

volledige samenvatting van de lessen methoden in het biomedisch onderzoek semester 1 jaar 3, KULeuven

Preview 4 out of 84  pages

  • December 14, 2024
  • 84
  • 2024/2025
  • Summary
avatar-seller
METHODEN:

THEMA 2: DNA


DNA SEQUENCTIEBEPALING :
De novo sequencing = ongekend genoom v bv nieuwe organismen/soorten, gedeeltelijk of volledig
Resequencing = seq v individu tov referentiegenoom, verschillen tss individuen (mutaties, klinisch)
Sequentiebepaling als teller = aant DNA molec

• Whole genome seq = WGS = het gehele genoom
• Whole exome seq = WES = enkel de coderende stukken/ exonen
• Targeted seq = specif gewenste regio
• Transcriptoom = RNA -> cDNA



1ST GENERATION SEQUENING :
Maxam en Gilbert = chemische klievingsmethode

• Differentiele chem klieving v NZ in 4 # reacties + scheiding volgens lengte (elektroforese)
• 4 tubes : C + C/T + G + G/A
• Nadeel = relatief korte fragm + niet volledig 1duidig/specifiek


Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie

• Template/matrijs = clone of PCR amplicon
• Polymerase + primer + mengsel 4 dNTP (≠2’OH) + ddNTPs (≠2’OH + 3’OH)
o Polymerase = thermostabiel + knn ddNTP en dNTP inbouwen zonder onderscheid
o Primer = tegen plasmide want fragm hierin of tegen pcrprimer

• Ketenterminatie na inbouw v fluor gemerkte ddNTP

• Gelelektroforese
o Phred score Q = -10log(P) = 1/Q is de kans op een fout
o Liefst Q = 30 = accuraatheid van 99,9% = 1/30 fout

• Nadeel = beperkt tot 500nt + moeite met herhalingen
o Veel G of C : 3Hbruggen = moeilijk los te komen en vormt lussen
▪ Fragment wordt kleiner dan oorspronkelijk is, sneller door scheiding
o Grotere betrouwbaarheid = reactie zowel met reverse als forward primer


Enorme impact:

• Techn ontwikkeling v sequencen: automatisering (↓kost + ↑seqdata) + aanpak
• Grote ontwikkeling v bioinformatica
• Visie op delen v data (open science, data)
• Andere methoden want nu bijna volledige seq beschikbaar
• Biol kennist: vergelijkende genomics (inzicht in evolutie, genetische verschillen,..)

1

,Nieuwe uitdagingen:

• Volledige seq (telomeer-telomeer)
• Meer genoom sequenecn v meerdere species
• Meer indiv humane seq
• Persoonlijke genoomseq v iedereen → personalized precision medicine
o Kennis v DNA volgorde en SNPs: diagnose, prognose, preventie
o Farmacogenetics: voorspellen hoe mensen op medicijnen reageren
o Inzicht op complexe multifactoriele aandoeningen (kanker)
o Therapie op maat


Probleem sanger sequencing = throughput + kosten




2D GENERATION SEQUENCING:
= next generation sequencing / short read NGS = massief parallel sequencen v clonaal in vitro

Doel = veel hogere throughput aan veel lagere kost → massale DNA seqbepaling
Richtdoel = 1 humaan genoom op 1 toestel per dag voor 1000 dollar per genoom

Ontwikkeling met 3pijlers:

• Parallele detectie : cluster = kopien v DNA template + clonale in vitro amplificatie v template
o Duizenden-miljoenen kopien v DNA template per cluster
o Multiplexing: vele clusters tegelijk
• Miniaturisatie v reacties (picoliters)
• Integratie vh proces: alles in 1 stap, directe detectie



Stap 1: aanmaak DNA library
= fragmentenbank = verzameling vd te sequencen templates

• Whole genome sequencing
• Whole exome sequencing / targeted sequencing : aanrijking door hybridisatie aan probes
o Hybridiseren op beads of array met oligont complementair aan exonseq
o Ofwel PCR: genomisch DNA met pool v PCR primers tegen alle exonseq en dus enkel
deze amplificeren en vervolgens sequencen
• Mate pair libraries
• Amplicon sequencing; PCR amplicons
• cDNA library (RNA sequencing)
o tellen v hvl bepaalde sequentie tot expressie komt



1. input DNA kwaliteitscontrole : hvlh + concentratie + zuiverheid (260/230 en 260/280) + integriteit

2. random fragmentatie: sonicatie, nebulisatie (verneveling), DNAse I




2

,3. end repair = blunt ends maken

• T4 DNA polymerase + klenow fragment: 5‘-3‘: polymerase / 3‘-5‘: exonuclease = proofreading

• T4 polynucleotide kinase: 5’ uiteinde fosforyleren
• Taq polymerase : 3’ non-template A aanhechten


4. adaptoren aanhechten:

• Nodig voor PCR primers + sequencing primers + eventueel barcodes
• Ligatie met fragm uiteinden (sticky end met 3’ A overhang of blunt-end)
• Selectie fragm met 2# adaptoren
• Enkele pcr cycli: fragm met adapters amplificeren


Selecteren fragmenten met 2# adaptoren:

• 2 soorten adaptoren : 1tje = gebiotinyleerd + 1tje niet
o Enkel dus fragm nodig met 2# adaptoren = aan 1 kant gebiotinyleerd
• Bead met streptavidine binden de adaptoren met biotine
o Juiste fragm binden met 1 kant aan bead
o Fragm met 2 adapt met biotine binden met 2 kanten + vormen lus
o Fragm met 2 adapt zonder biotine binden gwn niet
• Denaturatie : hierdoor lost fragm aan 1 kant v bead waardoor de juiste fragm nu ook lossen


Alternatief = tagmentatie : fragmentatie + adaptors aanhechten in 1 stap
→ transposase enzym met dubbele activiteit: knipt + voegt adaptors toe
→PCR cycli met toevoeging extra barcodes aan adaptors



5. size selection : gewenste lengte selecteren = niet te lang (niet seq) + niet te kort (adaptordimeren)

• Agarose gel elektroforese : gewenste lengtes uitsnijden + opzuiveren alcoholprecip
• Magentic beads dat DNA bindt : verhouding bepaalt lengte
o Kleine hvlh beads: bindt enkel lange fragm → beads capteren en wegdoen
o Grotere hvlh beads: bindt de middellange fragm → beads capteren + vlst weg
o Spelen met verhoudingen voor gewenste lengte + gebruikt platform


6. kwaliteitscontrole :

• Gewenste lengte + concentr inserts controleren + gewenste verhouding voor poolen libraries
• Capillaire elektroforese




3

, Stap 2: klonale in vitro amplificatie
= simultane, gescheiden amplificatie v miljoenen fragm niet in bacterie maar vaak met PCR

Emulsie PCR:

• Beads met PCR primers zullen de fragm vd fragmbank binden
o 1 fragm bindt met 1bead en amplificatie gebeurt op bead via PCR
• Beads = hydrofiel : waterlaag met alle reagentie voor reactie
• Beads gescheiden door olie = olie-emulsie:
o kleine waterdruppels in olie met elke druppel een reactievat
o 1000den aparte reacties in 1 buisje
o 1000den kopien v zelfde DNA molec gebonden op 1 bepaalde bead

• Beads met DNA fragmenten isoleren vd beads zonder DNA fragm
o 2de soort grotere beads met primer die alle beads capteren met fragm
o Densiteitscentrifugatie om deze te scheiden v elkaar


Solid phase bridge amplification:

• Vast oppervlak met oligont/PCR primers complementair aan de adaptoren
• DNA fragm bindt primers + amplificatie via PCR
• Door brownse beweging vormen de fragm lokaal bruggetjes
o Buigen af op korte afstand en binden met adaptor aan andere primer in buurt
o Zo aanmaak v complementaire streng en kan dit zich telkens herhalen
o Clusters = 1000den kopien v zelfde DNA molec op 1-2 µm spot


Solid phase template walking (wildfire):

• Vast oppervlak met oligont/PCRprimers complementair aan de adaptoren
• DNA fragm bindt primers + amplificatie via PCR
• Primer walking :
o PCRprimer seq zo gekozen dat die makkelijk lost : partiele denaturatie v dsDNA
o Het uiteinde zal dan naar naburige primer gaan op plaat en binden
o Opnieuw amplificatie via PCR
• Clusters = 1000den kopien v zelfde DNA molec


Rolling circle amplification (in oplossing):

• Specifieke adaptoren aanhangen die zorgen dat alles circuleert + bindingsplaats voor RE type 3
o Vormen v circulair DNA via ligatie
• RE 3 = endonuclease : knipt cirkel + ligeren v 2de set adaptoren
o dit wordt aantal keer herhaalt zodat we circulair dsDNA hebben met # sets v adaptoren
o 1 cirkel = # adaptoren met hiertss telkens een kort stuk oorspronk fragm om te seq
• Rolling circle amplificatie:
o Oorspronkelijke adaptor = bindingsplaats voor polymerase : start amplificatie
o Cirkel : geen stop v amplificatie + meerdere kopies
• Clusters = nanoballs = lange DNA molec met meerdere kopies v template na elkaar
o Deze hybridiseren op vaste drager


4

The benefits of buying summaries with Stuvia:

Guaranteed quality through customer reviews

Guaranteed quality through customer reviews

Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.

Quick and easy check-out

Quick and easy check-out

You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.

Focus on what matters

Focus on what matters

Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!

Frequently asked questions

What do I get when I buy this document?

You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.

Satisfaction guarantee: how does it work?

Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.

Who am I buying these notes from?

Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller ellaherroelen. Stuvia facilitates payment to the seller.

Will I be stuck with a subscription?

No, you only buy these notes for $8.09. You're not tied to anything after your purchase.

Can Stuvia be trusted?

4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)

51036 documents were sold in the last 30 days

Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 15 years now

Start selling
$8.09
  • (0)
Add to cart
Added