Samenvatting methoden in biomedisch onderzoek 3 : 15/20 behaald
13 views 1 purchase
Course
Methoden in het biomedisch onderzoek 3
Institution
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
bevat alle informatie van op de powerpoint + eigen notities aangevuld + goede indeling qua hoofdtitels en tussentitels voor structuur. Op einde van elk Hoofdstuk staat een witte pagina om het volgende hoofdstuk op een ONeven pagina te laten beginnen voor overzicht.
Van één (enkele) molecule(n) naar omics
▪ Next generation sequencing
▪ Massive parallel sequencing
▪ Nanopore sequencing
Multi-omics = data bij elkaar brengen om een compleet beeld te krijgen
Van ‘bulk’ naar ‘single cell’
▪ Bulk analyse = weefsel nemen, in mixer steken en zo alle klassen van moleculen nagaan
Output is gemiddelde van volledige weefsel
└ Vb. spatiale transcriptomics om na te gaan welk transcript op welke plaats & zo
verschillende celtypes zien
▪ Single cell analyse = cellen uit weefsel halen en omics doen op single cellen
Ruimtelijke informatie verloren
└ Vb. single cell transcriptomics om cellen uit elkaar te halen en te mappen
Interactomics = interacties tussen moleculen nagaan
Pathway analyse en fluxomics
▪ Via merkersubstraat (vb. C13 gemerkt glucose) volgen wat er gebeurt & zien hoe het
metabolisme is veranderd in een bepaalde ziekte
Genmodulatie = aantonen dat gen rol speelt in ziekte door gen te veranderen
1
,2
, DNA (2)
A: DNA SEQUENTIEBEPALING
methoden:
1) first-generation sequencing
o bulk sequencen
o Sanger, cloneren & elektroforese
o gouden standaard voor kleine projecten
2) second- / next-generation sequencing
o massief parallel sequencen ( miljoenen tegelijk)
o via clonaal geamplificeerde DNA moleculen
o bv ilumina
3) third- / next-next-generation sequencing
o individuele DNA moleculen sequencen zonder eerst amplificeren
o bv nanopore
➔ evolutie in capaciteit, snelheid en kosten
toepassingen:
▪ de novo genoom sequentiebepaling
ongekende genomen, nieuwe organismen ( bv Sars-CoV-2)
gedeeltelijk of volledig
in stukken gebeuren, dan kijken naar overlaps & vervolgens aan elkaar hangen
bv: humaan genoom project
▪ resequencing
mutaties = zeldzame veranderingen gelinkt aan ziektes
verschillen tussen individuen (SNPs)
referentiegenoom voor nieuwe individuen
gekend genoom van organisme
▪ sequentiebepaling als teller
aantallen DNA of RNA moleculen bepalen als teller
weten hoe vaak bepaald gen tot expressie komt in bepaald weefsel
RNAseq, ChiPseq,…
3
,1: 1ste generatie sequentiebepaling
Maxam & Gilbert
principe:
▪ differentiële chemische klieving van nucleïnezuren in 4 verschillende reacties
▪ dan scheiding op gel volgens grootte
▪ dan visualisatie via autoradiografie
korte fragmenten
niet helemaal specifiek
werking:
analyse van de radio-actieve bandjes met de korte fragmentjes onderaan en de lange bovenaan.
Letter G boven de rij omdat enkel daar de bandjes een kleur geven. A & G omdat ze op die positie een
kleur geven.
▪ template/matrijs
: gefragmenteerd genoom geamplificeerd door kloneren / specifiek fragment geamplificeerd
door PCR
▪ polymerase + primer + mengsel 4 dNTPs + ddNTPs, elk met ander fluorescent label
▪ reactie loopt na inbouwen dNTP & stopt na inbouwen ddNTP
▪ !! verhouding dNTPs/ddNTPs
▪ Scheiden strengen: gel of capillair : elektroferogram
▪ 1 streng per keer aflezen
▪ 2 reacties voor betrouwbaarheid (FW en RV primer) = beide richtingen aflezen
beperkt tot 500 bp
moeite met herhalingen
Groen template: via polymerase maak je nieuwe DNA dat vertrekt vanuit een primer.
4dNTP’s & kleine hoeveelheid ddNTP’s. waarom dd? DNA is altijd deoxy ( zuurstof minder). Di omdat
er een H staat i.p.v. een OH. Aan de O kan er niets gebonden worden waardoor de reactie wel door kan
gaan.
▪ kwaliteitsscores = Phred score
o -10log10(P)
o 1ste 30 bp niet afleesbaar
o Meestal 500-700 bp goede sequentie afleesbaar
o P = probabiliteit van foutieve base call
o als Q=30 ⇒ 1/1000 kans op een fout
5
,verwezenlijkingen met 1ste generation sequencing:
a) human genome project (HGP)
~ grootste multinationale biologisch project ooit
~ stalen meerdere anonieme individuen
~ methode: hierarchical shotgun sequencing met Sanger methode
~ clones in YACs, BACs, P1s en cosmiden
b) human genome sequencing door Celera
~ Door Craig Venter
~ Stalen van 5 individuen
~ Methode: whole genome shotgun sequencing
~ Draft sequentie 2001
Enorme impact op
▪ Technologische ontwikkeling van sequencing
▪ Grote ontwikkeling van bioinformatica
▪ Visie op delen van data
▪ Andere methoden omdat nu de (bijna) volledige sequentie beschikbaar is
▪ Biologische kennis
Nieuwe uitdagingen
▪ Volledige sequentie (telomeer tot telomeer)
▪ Meer genomen sequencen van meerdere species
▪ Meer individuele humane sequenties
▪ Persoonlijke genoomsequentie van iedereen
Enorme mogelijkheden voor “personalized precision medicine”
▪ Kennis van DNA volgorde en SNPs → diagnose, prognose, preventie
▪ Farmacogenomics verklaart waarom en voorspelt of bepaalde individuen goed/slecht reageren
op geneesmiddelen
▪ Inzicht in complexe multifactoriële aandoeningen
▪ Therapie op maat
Probleem met standaard Sanger sequencing: throughput en kosten → andere technologie
nodig met hoge capaciteit en lage kosten
▪ veel hogere throughput aan veel lagere kosten ⇒ massale DNA sequentiebepaling mogelijk
▪ richtdoel: 1 humaan genoom op toestel per dag voor < 1000USD
▪ parallelle detectie = massieve parallel sequencing
cluster/ polony = kopieën van DNA template die ruimtelijk dicht bij elkaar liggen
klonale in vitro amplificatie van template
: duizenden-milj kkopieën van DNA template per cluster
multiplexing = veel clusters tegelijk ( vs 1 template/reactie)
▪ miniaturisatie van reacties
▪ integratie van het proces
directe detectie (<> scheiding via gel)
1 proces i.p.v. verschillende stappen
Gebaseerd op 4 basisstappen:
STAP 1: aanmaak next-generation sequencing DNA library
library = fragmentenbank = verzameling te sequencen templates
types DNA library:
~ WGS
~ WES
~ targeted sequencing
~ amplicon sequencing
~ minimum bias en voldoende complexiteit (voldoende verschillende fragmenten)
7
,kwaliteitscontrole input DNA:
▪ hoeveelheid en concentratie
▪ zuiverheid bv spectrofotometrie A260/280 en A260/230 ratio
▪ integriteit bv capillaire elektroforese
3) end repair
blunt ends maken:
o T4 DNA polymerase: afknippen fragmenten
o Klenow fragmenten : aanvullen van fragmenten
5’ uiteinde fosforyleren door T4 polynucleotide kinase
o Fosforylatie ! voor adaptoren vast te hangen
eventueel non-template A aan 3’ uiteinde door Taq polymerase
4) ligatie adaptors
adaptor = stukje gekende sequentie, bindt & sequencing primer + barcode
ligatie met uiteinden: sticky end met 3’A overhang of blunt-end ( A bindt aan T)
om bank te kunnen amplificeren via PCR & zodanig dat sequencing primers
kunnen binden
5) eventueel tagmentatie
fragmenteren + adaptors aanhechten in 1 stap
transposase enzym knipt en voegt adaptors toe
PCR cycli met toevoeging extra barcode aan adaptor
8
,6) size selection
doel: gewenste lengte insert selecteren
vroeger: agarose gel elektroforese, gewenste lengte uitsnijden en opzuiveren
nieuw: magnetische beads aan DNA & verhouding DNA/beads geeft lengte:
o 1-zijdig of 2-zijdig: te lange fragmenten uitselecteren & wegfilteren
o 1-zijdig: korte fragmenten : zoals adapter-dimeren wegfilteren
o 2-zijdig: kleine & grote fragmenten
100-200 miljoen clusters van telkens 1000 kopieën van zelfde DNA template
Doel: simultaan maar gescheiden, amplificatie van miljoenen fragmenten
verschillende methoden om scheiding tussen clusters te behouden
Emulsie PCR Solid-phase template walking ‘wildfire’
Bv: 454 Bv SOLiD
Beads met nt complementair aan adaptoren Oppervlak met nt complementair adaptoren
Toevoeging PCR reagentia Fragmentatie laten binden
Olie-emulsie maken: beads van elkaar scheiden door Partiële denaturatie (T lichtjes los)
olie : vrij uiteinden (adaptor) ‘wandelen’ lokaal & binden
In elke microdruppel: 1 bead met 1 fragment op naburige primer
On-bead amplificatie in emulsie Amplificatie: 1000den lokale clusters
Solid-phase bridge amplificatie Rolling-circle amplificatie in oplossing
Bv ilumina Bv complete genomics
Vaste opp met nt complementair adaptoren 4 adaptoren (rood) ligeren aan fragment
Fragmenten vormen lokaal bruggetje via brownse Circulaire DNA template via ligatie
beweging Knippen downstream met type III endonuclease
PCR 2e set adaptoren: ligatie, circiuarisatie & knippen
Clusters (polonies) = 1000den kopieën van zelfde Herhalen met nog 2 andere adaptoren
DNA molecule gebonden op 1-2 microm spot Rolling circle amplificatie
Clusters = nanoballs = concatemeren = lange DNA
moleculen met meerdere kopieën van template na
elkaar
Hybridisatie op vaste drager
10
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller charlotteallaert1. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $17.18. You're not tied to anything after your purchase.
