Dit is een eigen getypte samenvatting voor het vak biochemische technieken, deel 3. Het vak wordt gegeven door mevrouw Soetaert in het derde jaar Biochemie (afstudeerrichting van chemie). In de samenvatting staan delen aangeduid die ze in de les aangaf als examenvragen.
1.3 Oplossend vermogen van een kolom.........................................................................4
1.3.1 Invloed van kolom...............................................................................................4
1.3.2 Invloed van het fasensysteem.............................................................................5
1.3.2.1 Capaciteitsfactor k’........................................................................................5
1.3.2.2 Relatieve retentie of scheidingsfactor .........................................................5
1.3.3 Invloed van k’, en N op de resolutie R...............................................................6
2.2 Samenstelling van de gelkorrels................................................................................7
2.3 Zwellen van de gelkorrels.......................................................................................... 8
2.4 Verwijderen van lucht................................................................................................ 8
2.5 Kwantitatieve benadering.......................................................................................... 8
2.5.1 Samenstelling van het kolomvolume...................................................................8
2.5.2 Elutievolume........................................................................................................ 8
, » Gewerkt met grote korrels, grote kolommen en lage druk (peristatisch
pompje)
» Voordeel: voor preparatieve bereidingen + grote monsters
» Nadeel: tijdrovend en beperkte resolutie
» Biomoleculen om te scheiden (EW of NZ)
Fast performance liquid chromatografie = FPLC
1.2 Begrippen en formules
1.2.1 Begrippen
Begrip Definitie
Tijd tussen opbrengen van staal en
Retentietijd tR
piekmaximum
Tijd die solvent nodig heeft om door
Dode tijd to
kolom te migreren
Tijd tussen verschijnen van piekmaximum
Netto retentietijd t’R
en de solventpiek
HETP Hoogte equivalent met theoretische plaat
Verwijderen van product van kolom door
Elutie
oplossing in eluens
Eluaat Eluens dat uit kolom komt
Solventreeks gerangschik volgens
Elutrope reeks
stijgende eluerende kracht
Snelheid waarmee mobiele fase door
Flow rate
kolom gaat
Sedimentatie Gesuspendeerde deeltjes die uitzakken
Stationaire fase lagere polariteit dan
Reversed phase
mobiele fase
Maat voor de scheidingscapaciteit van de
Resolutiefactor R
kolom
Verhouding van concentraties in de
Verdelingscoëfficiënt K
stationaire en mobiele fase
Verhouding van hoeveelheden in
Capaciteitsfactor k’
stationaire en mobiele fase
Invloed van de pakking op de lineaire
Permeabiliteit Kp
snelheid
1.2.2 Formules
Schotelgetal: bepaalt efficiëntie van kolom en slaat op 1 component
tr 2
N = 16. = 5,55
w
tr
2
w 1/2
R = 1: W +W = 2*(t -
2∗(t ' R 2−t ' R 1) 1 2 R1
Resolutie = R = tR2)
w 1+ w 2 R < 1: overlap tussen
pieken
Lineaire snelheid
μ= ν=
L hoeveelheid component ∈mobiele fase
tm totale hoeveelheid component
3
1.3 Oplossend vermogen van een kolom
Bepaald door efficiëntie van kolom en fasensysteem
Goed
resultaat: en N zijn groot
1.3.1 Invloed van kolom
Van Deemtervergelijking:
B
H=A+ +
μ
Onvolledige
Eddy Longitudale
evenwichtsinstelli
diffusie diffusie
ng
H = HETP
H = A + B’ * T
= lineaire
4
C' elutiesnelheid
+
T T = temperatuur
, Te lage snelheid: te veel diffusie
Te hoge snelheid: onvoldoende uitwisseling tussen de 2 delen
Eddy-diffusie
A = 2**dP
( = stapelingsfactor en dP = diameter korrels)
Als korrels verschillend zijn van grootte en 2 dezelfde moleculen gaan door kolom
Gelijke moleculen volgen niet allemaal zelfde weg krijgen verschillende
snelheid (oranje en roze lijnen)
Verschillende verblijftijd in kolom geeft bredere of smallere pieken
Diameter van korrels geeft verschillende vormen
Goede kolom heeft beads met gelijke grootte en ook kleine beads
Longitudinale diffusie
B = 2*Q*Dm (niet bolvormige deeltjes)
k .T k .T
Met D = = (bolvormige deeltjes)
f 6∗π∗η∗R
Draagt ook bij tot de zoneverbreding
Hoe minder lang component in mobiele fase, hoe minder verbreding
Evenwichtsinstelling
k ' df 2 k' dp 2
C = C’S * + Cm ’ 2
*
(1+k ) Ds
' 2
1+ k ' Dm
Weerstand tegen stofoverdracht
Te grote elutiesnelheid geeft onvolledige evenwichtsinstelling en dus
piekverbreding (willen C zo laag mogelijk)
1.3.2 Invloed van het fasensysteem
1.3.2.1 Capaciteitsfactor k’
Maat voor de vertraging van een component door de stationaire fase
Cs∗Vs
Kenmerken: k’ = =
Cm∗Vm
» Afhankelijk van temperatuur
» Onafhankelijk van kolomlengte en elutiesnelheid tR =
'
» Afhankelijk van contactoppervlak met stationaire L(k +1)
» Afhankelijk van polariteit van mobiele fase μ
» Beïnvloedt de retentietijd
» Ideale waarden liggen tussen 1 en 5
» Hoe groter k’ hoe groter de scheidingstijd en omgekeerd
1.3.2.2 Relatieve retentie of scheidingsfactor
5
, Maat voor de selectiviteit van fasensysteem
α= α=
t' R 2 k'2
'
t R1 k'1
1.3.3 Invloed van k’, en N op de resolutie R
Bij R = 1,0 overlappen pieken elkaar voor 2%, componenten zijn
98% gescheiden
Bij R = 1,5 is de overlapping maar 0,3%, de componenten zijn
99,7% gescheiden
Bij R = 0,5 is de scheiding nog zeer onvolledig
Indien R < 1 dan kan men de resolutie verhogen door een van de 3 factoren te
verhogen
Invloed schotelgetal: smalle of brede pieken
Invloed capaciteitsfactor: maat voor vertraging van de stationaire fase
Invloed relatieve retentie: afstand tussen pieken
Invloed op resolutie: als we N met factor 4 verhogen, zal resolutie verhogen met
factor 2
Invloed op retentietijd: als resolutie x2 verhoogd zal retentietijd x4 verhogen (bij
behoud vd elutiesnelheid)
1.4 Indeling chromatografie
Technieken:
» Affiniteitschromatografie: scheiding obv reversibele interactie tussen
doeleiwit en ligand op matrix
» Ionchromatografie: scheiding obv interactie tussen geladen eiwit en
tegengesteld geladen
matrix
» Gelfiltratie: scheiding
obv verschil in vorm en grootte
» Hydrofobic interaction: scheiding obv
interactie tussen eiwit en hydrofobe
oppervlak in medium
» Reverse fase: scheiding obv hydrofobiciteit
Elke stap moet op 4 punten geoptimaliseerd
worden: resolutie, opbrengst, snelheid en capaciteit
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller LouisePeeters. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.70. You're not tied to anything after your purchase.
