Dit is een eigen getypte samenvatting voor het vak biochemische technieken, deel 3. Het vak wordt gegeven door mevrouw Soetaert in het derde jaar Biochemie (afstudeerrichting van chemie). In de samenvatting staan delen aangeduid die ze in de les aangaf als examenvragen.
1.3 Oplossend vermogen van een kolom ........................................................................................... 4
1.3.1 Invloed van kolom ................................................................................................................. 4
1.3.2 Invloed van het fasensysteem ................................................................................................ 5
1.3.2.1 Capaciteitsfactor k’ ........................................................................................................ 5
1.3.2.2 Relatieve retentie of scheidingsfactor a ........................................................................... 5
1.3.3 Invloed van k’, a en N op de resolutie R .................................................................................. 5
1.1 Inleiding
> Standaard vloeistofchromatografie = LPC
» Gewerkt met grote korrels, grote kolommen en lage druk (peristatisch pompje)
» Voordeel: voor preparatieve bereidingen + grote monsters
» Nadeel: tijdrovend en beperkte resolutie
» Biomoleculen om te scheiden (EW of NZ)
> Fast performance liquid chromatografie = FPLC
1.2 Begrippen en formules
1.2.1 Begrippen
Begrip Definitie
Retentietijd tR Tijd tussen opbrengen van staal en piekmaximum
Tijd die solvent nodig heeft om door kolom te
Dode tijd to
migreren
Tijd tussen verschijnen van piekmaximum en de
Netto retentietijd t’R
solventpiek
HETP Hoogte equivalent met theoretische plaat
Verwijderen van product van kolom door
Elutie
oplossing in eluens
Eluaat Eluens dat uit kolom komt
Solventreeks gerangschik volgens stijgende
Elutrope reeks
eluerende kracht
Flow rate Snelheid waarmee mobiele fase door kolom gaat
Sedimentatie Gesuspendeerde deeltjes die uitzakken
Reversed phase Stationaire fase lagere polariteit dan mobiele fase
Resolutiefactor R Maat voor de scheidingscapaciteit van de kolom
Verhouding van concentraties in de stationaire en
Verdelingscoëfficiënt K
mobiele fase
Verhouding van hoeveelheden in stationaire en
Capaciteitsfactor k’
mobiele fase
Permeabiliteit Kp Invloed van de pakking op de lineaire snelheid
1.2.2 Formules
> Schotelgetal: bepaalt efficiëntie van kolom en slaat op 1 component
$, $,
N = 16.[ )
] 2 = 5,55 [ )'/! ] 2
. . )
HETP = / = '0 [ $% ] 2
!∗($ ! %!&$ ! %') R = 1: W1+W2 = 2*(tR1-tR2)
> Resolutie = R = )'*)! R < 1: overlap tussen pieken
R > 1: goede scheiding
> Lineaire snelheid
H = HETP
@E
H = A + B’ * T + µ = lineaire elutiesnelheid
F
T = temperatuur
> Te lage snelheid: te veel diffusie
> Te hoge snelheid: onvoldoende uitwisseling tussen de 2 delen
4
,Eddy-diffusie
> A = 2*l*dP
> (l = stapelingsfactor en dP = diameter korrels)
> Als korrels verschillend zijn van grootte en 2 dezelfde moleculen gaan door kolom
> Gelijke moleculen volgen niet allemaal zelfde weg à krijgen verschillende snelheid (oranje en
roze lijnen)
> Verschillende verblijftijd in kolom geeft bredere of smallere pieken
> Diameter van korrels geeft verschillende vormen
> Goede kolom heeft beads met gelijke grootte en ook kleine beads
Longitudinale diffusie
> B = 2*Q*Dm (niet bolvormige deeltjes)
G.F G.F
> Met D = =
= 0∗I∗J∗% (bolvormige deeltjes)
> Draagt ook bij tot de zoneverbreding
> Hoe minder lang component in mobiele fase, hoe minder verbreding
Evenwichtsinstelling
GE 8= " GE 8:"
> C = C’S * ('*G !)" + Cm’[ '*GE ] 2 * K1
K?
> Weerstand tegen stofoverdracht
> Te grote elutiesnelheid geeft onvolledige evenwichtsinstelling en dus piekverbreding (willen C zo
laag mogelijk)
1.3.2 Invloed van het fasensysteem
1.3.2.1 Capaciteitsfactor k’
> Maat voor de vertraging van een component door de stationaire fase @?∗A? A?
k’ = @1∗A1 = K * A1
> Kenmerken:
» Afhankelijk van temperatuur
.(G ! *')
» Onafhankelijk van kolomlengte en elutiesnelheid tR = C
» Afhankelijk van contactoppervlak met stationaire
» Afhankelijk van polariteit van mobiele fase
» Beïnvloedt de retentietijd
» Ideale waarden liggen tussen 1 en 5
» Hoe groter k’ hoe groter de scheidingstijd en omgekeerd
1.3.2.2 Relatieve retentie of scheidingsfactor a
> Maat voor de selectiviteit van fasensysteem
$ ! %! GE!
𝛼= 𝛼 = GE'
$ ! %'
1.3.3 Invloed van k’, a en N op de resolutie R
> Bij R = 1,0 overlappen pieken elkaar voor 2%, componenten zijn 98% gescheiden
> Bij R = 1,5 is de overlapping maar 0,3%, de componenten zijn 99,7% gescheiden
5
, > Bij R = 0,5 is de scheiding nog zeer onvolledig
> Indien R < 1 dan kan men de resolutie verhogen door een van de 3 factoren te verhogen
> Invloed schotelgetal: smalle of brede pieken
> Invloed capaciteitsfactor: maat voor vertraging van de stationaire fase
> Invloed relatieve retentie: afstand tussen pieken
> Invloed op resolutie: als we N met factor 4 verhogen, zal resolutie verhogen met
factor 2
a -1 k' 1 L
R= . ' 2 .
a k2 + 1 4 H
> Invloed op retentietijd: als resolutie x2 verhoogd zal retentietijd x4 verhogen (bij
behoud vd elutiesnelheid)
1.4 Indeling chromatografie
> Technieken:
» Affiniteitschromatografie: scheiding obv reversibele interactie tussen doeleiwit en ligand
op matrix
» Ionchromatografie: scheiding obv interactie tussen geladen eiwit en tegengesteld
geladen matrix
» Gelfiltratie: scheiding obv verschil in vorm en grootte
» Hydrofobic interaction: scheiding obv interactie tussen eiwit en hydrofobe oppervlak in
medium
» Reverse fase: scheiding obv hydrofobiciteit
> Elke stap moet op 4 punten geoptimaliseerd worden: resolutie, opbrengst, snelheid en capaciteit
1.6 Matrixmateriaal
> Goede elutie-eigenschappen: grootte en porositeit zijn bepalend
> Hydrofiele karakter: gelkorrels eerst zwellen
> Chemische resistentie: tegen wisselende omstandigheden
> Biologisch resistent
> (mesh-waarde = distributie van de korrelgrootte)
6
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller LouisePeeters. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.69. You're not tied to anything after your purchase.
