Summary
Samenvatting methoden 2
- Course
- Institution
Volledige samenvatting van methoden 2. Alle hoofdstukken worden hierin besproken buiten hoofdstuk 1 en 2 aangezien dit inleiding is. Dus H3, H4, H5, H6, H7 en H8.
[Show more]
Seller
Follow
marthedegraeve
Content preview
Hoofdstuk 3: RNAInleiding
DNA vs RNA
DNA RNA
Thymine (stabieler) Uracil
Deoxyribose (geen 2’OH) Ribose (wel 2’OH) —> vatbaar voor
afbraak door RNAsen
Stabiel Makkelijker modi caties
Ds Ss
Kan secundaire/ tertiaire structuur
hebben
ddNTPs bij Sanger sequencing => ook
geen 3’OH => geen ketenverlenging
(fosfodiesterbinding))
Soorten RNA
tRNA => TLN naar eiwitten
mRNA = boodschap voor TLN
rRNA (95%) => veel aanwezig DUS voor
kwaliteitscontrole
lncRNA = lang (>200 nt)
siRNA = kort => moduleren cellen
miRNA = kort (<200 nt) => reguleren TXN (genexpressie)
Niet coderend RNA
mRNA
DNA —> pre-mRNA —> mRNA (matuur) —>
polypeptide
Splicing = verwijderen
• Pre-MRNA (tijdelijk) = 5’cap + exonen +
intrionen + polyAstaart
• mRNA: 5’cap + 5’UTR + 3’UTR + polyA
=> niet naar eiwit
5’cap en polyA niet gecodeerd maar post-transcriptie toegevoegd
1
,Voorzorgen en bewaren voor problemen
Modi catie RNA in staal (RNA instabiel <>DNA)
= Degradatie (dmv endogene/exogene bv.RNAse) + inductie genen
Anticoagulans EDTA bij staalname <> heparine (inhibeert RNA reactie)
RNA stabilisatie => langer bewaren
• snel werken, inviezen (vloeib. N2),
• RNA bewaarmiddel => langer bewaren bij Tkamer
—> bij
bloed (bv.PAXgene tube)/ bij cellen bv. Trizol (1e stap extractie) of RNAlater
(voor extractie): (NH₄)₂SO₄ -opl. => neerslag eiwitten (RNAse = eiwit)
RNAse vrij werk
labojas, handschoenen, RNAse schoonmaakproduct, buffer/water bewerken met RNAse
inhibitor => nuclease-vrij
bv. DEPC (carcinogeen): reactie amines van AZ in katalytic site(!niet in Trisbuffer:
Tris= amine)
Bewaring RNA
• In RNAse vrij water/ TE buffer (EDTA inhib. enkel DNAsen), op -80°C (1jaar
<DNA), als alcoholprecipitaat,, meerdere aliquots in RNA bewaarmiddel => later
RNA extractie
DNA contaminatie bij RNA extractie
(!moeilijker DNA verwijderen van RNA dan RNA van DNA)
• Niet altijd probleem
• Detectie via electroforese of RTmin controle
• DNAse behandeling ALS contaminatie WANT ook verlies/degradatie RNA
= DNAse(I) tijdens/na extractie RNA => knip DNA + hitte inactivatie/ verwijderen
DNAse
2
,RNA extractie
! vgl met DNA extractie
Lysis van staal = kapot maken cellen
= breken cellen (RNA vrij) => lysaat/ homogenaat = vl. met inhoud cellen (afh.
startmateriaal en doel)
Vaak toevoeging remmers van niet-gewenste moleculen, bv DNasen, RNAasen,
proteasen,…
Methoden voor lysisch (afh. weefsel, celtype, V, …):
• Detergent toev. (meestal) bv. SDS, Trizol (guanidium thiocyanaat), guanidium
chloride..=> lysis
• Vriezen en ontdooien (snel) => lyseren (kapot maken) cellen
( <> cryopreservatie (=traag) om cellen intact/leefbaar te houden)
• Mechanische homogenisatie:
• stikstof
• Bead-gebaseerde homogenisator: beads (= kralen) in buis met cellen +
schudden => homogenaat
• Vloeibare homogenisatie: dounce homogenisator/ douncer: oplossing tussen
glazen pestels => bewegen => vloeistofstroom => lyseren cellen
• Positief: milder: organellen intact (<> mechanische)
• Sonicatie (geluidsgolven) => OOK DNA/ RNA fragmenteren (bv. bij Sanger: DNA
frag nodig)
3
, Isoleren/extractie RNA
= RNA uit lysaat opzuiveren (geen eiwitten, DNA,…) dmv
organisch solvent, alcoholprecipitatie of
kolomchromatogra e
Organisch solvent = Trizol = “in huis” protocol
= guanidium thiocyanaat (zuur: pH 4) – fenol – chloroform
—> detergent => cel lysis + RNAse inhibitor (=> RNA intact)
Werking:
• organische- + inter- + waterlaag met RNA (boven) => overbrengen H20 laag tube
=> alcoholprecipitatie/ kolomchromatogra e => isolatie RNA
• makkelijk, goedkoop, goede oprengst
Vergelijk DNA:
fenol – chloroform voor extractie DNA (pH=7 <> Trizol = zuur) RNA (negatief Q:
polair) altijd in H20 laag <> DNA in H20 of organische/ interlaag afh. van pH
(negatief Q/neutr.)
Alcoholprecipitatie supernatans (precipitatie = neerslag)
= idem DNA
DNA & RNA (P0 -) neerslag bij toevoegen zout (bv Na+, Na-acetaat) + alcohol
(ethanol, isopropanol)
=> Neg. DNA neutr. door Na+ (=hydrofoob)+ alcohol => neerslag uit opl. => vlokje
(bij lage conc.: lagere temp. Of drager (glycogeen) toev. => beter zichtbaar)
=> RNA/DNA pellet oplossen in water/buffer
1e organisch/kolom => DNA/RNA dan precipitatie => neerslag DNA/RNA
—> DNA extractie: RNAsen toev => enkel DNA
—> RNA extractie (moeilijker) : 1e test of contaminatie DNA, 2e DNAsen (want RNA
verlies)
Kolomchromatogra e
1e RNA (/DNA) bindt selectief silica kolom dmv zout + pH condities => rest loopt
door (!DNA niet 100%)
2e Elutie RNA door … condities
Opstelling:
lysaat in kolom (silica/anionenuitwiss.) => vloeistof door kolom (dmv centrif., Fz of
vacuüm)
Positieve eigenschappen
• eenvoudig, zeer goede zuiverheid
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller marthedegraeve. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $14.84. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
48756 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 15 years now