Summary
Samenvatting - Moleculaire biologie en DNA technologie
- Course
- Institution
Volledige samenvatting van Moleculaire biologie en DNA technologie. 50 pagina's
[Show more]
Seller
Follow
Rielle
Content preview
Samenvatting Moleculaire biologie en DNA technologieHoofdstuk 1: Isolatie van nucleïnezuren
1.1 Nucleïnezuren
DNA en RNA
Structuur van DNA:
5’ vrije fosfaatgroep
3’ vrije OH-groep
Antiparallelle strengen
Waterstofbruggen
Bewaren genetische informatie
Structuur van RNA:
Veel lagere stabiliteit dan DNA
Snelle turnover -> reguleerbaar
Enkelstrengig
Interacties met eiwitten, dna en kleine rna-bindende moleculen aangaan
MiRNA, rRNA, tRNA, IncRNA
Het Genoom van pro- en eukaryoten
Kern: histoneiwitten en nucleosoom, chromatine en chromosomen, euchromatine en
heterochromatine
Mitochondiën
Chloroplasten
Chromosomen zitten in de mitose-metafase in de celcyclus
1.2 Isolatie nucleïnezuren
1.3
Isoleren van DNA uit cellen of weefsels
DNA isolatie:
Zuiver DNA nodig voor enzymatische down stream toepassingen
Enzymwerking wordt verstoord wanneer DNA niet zuiver is.
VRAGEN:
Hoe cellen openbreken om DNA uit te isoleren: lysemethode, voorbereidende stappen
Chemisch, biologisch, fysisch, mechanisch, combinatie
Cellyse: Verschil eukaryoten en prokaryoten, verschil in celarchitectuur, verschillende
lysemethoden, verschillende voorbehandelingen nodig.
,n
Chemisch:
1. Detergent (SDS)
2. Alkalische buffer (NaOH)
Biologisch:
3. Proteïnase K
Breekt eiwitten af op de celmembraan en gebonden op nucleïnezuren.
Breed- spectrum proteïnase
Knipt na hydrofobe aminozuren
Eiwitten degraderen
Nucleasen onschadelijk maken
Temperatuur 56° C
Stabiel over een breed pH bereik ( ideaal bij 8)
Buffer:
Activiteit omhoog door detergenten, en chaotrope stoffen
o Want -> denatureren het substraat waardoor dit beter
toegankelijk wordt voor het enzym
Combinatie van verschillende methoden:
4. In humane cellen:
Proteïnase K en detergent en warmte Lysebuffer voor nucleïnezuurisolatie
Chaotrope stof of chaotroop zout
GuSCN, ethanol, SDS, Ureum, guanidiumchloride, MgCl2, fenol
Verhoogt de entropie door interfereren met intermoleculaire
krachten:
o Waterstofbruggen
o Van der Waals krachten
o Hydrofobe effecten
, Verbreken watermantel rond DNA, denatureren eiwitten,
bescherming DNA door inactivatie nucleasen, verhogen
membraanpermeabiliteit hydrofoobeffect
Lysozyme (biologisch)
5. Hydrolyseert peptidoglycaan
6. Breekt celwand van grampositieven open
Hoe zuiveren we het DNA? Hoe verwijderen we de overige celcompomenten?
Cellysaat bevat: DNA in waterige oplossing, RNA in waterige oplossing, afbraakmateriaal van
cel, detergens, proteïnase K, chaotroop agens,…
Verschillende DNA- isolatietechnologieën (zie scheidingstechnieken)
1. Vroeger:
Fenol- chloroform extractie maar schadelijke producten
2. Sinds 1990: Boom- “Extractie”
Kolomchromatografie
Extractie: fenol-chloroform
1. Waterige fase: DNA
2. Interfase: celdebris
3. Organische fase: proteïnen, lipiden
4. VOORDELEN:
Zeer zuiver DNA
Zeer goede opbrengst
5. NADELEN:
Tijdrovend
Isopropanol precipitatie
Schadelijke organische solventen
Residuele organische solventen interfereren met DNA- concentratiebepaling
en enzymatische DNA- manipulatie
Boom- “Extractie”: Silicakolommen
1. Adsorbtie van DNA op silicagel
Samenstelling bindingsbuffer:
Hoge zoutconcentratie en chaotroop agens
Functie bindingsbuffer:
Verwijderen watermantel van DNA
Verwijderen watermantel kolom
Vormen kationbrug tss silicakolom en negatief geladen DNA
2. Verwijderen van contaminanten
Wassen:
Ethanol en hoge zoutconcentratie
, DNA blijft gebonden aan de kolom
Contaminanten worden weggewassen
Verwijderen enzyminhibitoren
3. Elutie van DNA
Lage zoutconcentratie
Geen carry-over van ethanol
4. VOORDELEN:
Snel
Minder schadelijke organische solventen
Zuiver en geconcentreerd DNA
Makkelijk te automatiseren
Hoe bewaren we DNA?
Hoeveel DNA kunnen we zuiveren uit een bepaald monster/staal?
Hoe bewaren we het startmateriaal?
Buffer:
1. Dnase-vrij water
2. Tris-EDTA buffer ( DNA blijft langer stabiel maar mogelijks nadeel door downstream
applicaties)
Temperatuur:
1. Standaard: bij -20°C
2. -80°C voor heel lange periode
Startmateriaal kan bewaard worden (6maand) na toevoegen proteïnase K
Elutievolume hangt af van de hoeveelheid DNA
Kwantitatief:
DNA-concentratie
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller Rielle. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $10.56. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
56880 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 15 years now