Methods in Biomedical Research
Organismen kunnen op vele verschillende niveaus onderzocht worden:
Volledig organismen Bv. gedrag, toxiciteit van iets…
Weefsels en organen Door dissecties.
Afzonderlijke cellen Micro-organismen, in vitro culturen, gemalen weefsels of organen,
enzymatische dissecties.
Subcellulaire organellen Door celdisruptie.
Geïsoleerde Uit cellen of organellen
macromoleculen
1. Cell cultures
Weefsels en celculturen kunnen gebruikt worden om het gedrag van (dierlijke) cellen te bestuderen
zonder de systematische variaties die kunnen voorkomen in volledige dieren.
1. Orgaanculturen
De weefselexplantaat1 behoudt (minstens voor een deel) zijn architecturale eigenschappen en wordt
in een cultuuromgeving geplaatst die behoudt van de originele 3D-vorm promoot.
2. Primaire explantaatculturen
Een stukje van een weefsel wordt geplaatst op een vloeistof-vaste stof oppervlak. Na aanhechten,
groeien de cellen uit op het substraat (outgrowth). De cellen kunnen migreren over het oppervlak. Er
ontstaat dus een 2D netwerk (kan een nadeel zijn).
3. Celculturen
Het weefsel of de cultuur van de primaire explant wordt mechanisch of enzymatisch
gedessaggregeerd in een celsuspensie. De celsuspensie kan in cultuur gebracht worden als een
aangehechte monolayer of een niet-aangehechte suspensie.
1.1 Geschiedenis
Rond 1950 vond een doorbraak i.v.m. celculturen plaats. Sindsdien kende ze een sterke evolutie:
- In 1948 werd voor het eerste antibiotica gebruikt bij weefselculturen.
- In 1952 werd de HeLa cellijn ontwikkeld.
- In 1955 werden gedefinieerde celcultuurmedia ontwikkeld.
- In 1970 werd de laminaire flow cabinet voor celculturen ontwikkeld.
- In 1998 werd het eerste tissue engineered kraakbeen in cultuur gebracht.
1
Een explantaat of explant is een sample van levende cellen/weefsel, bekomen uit een organisme.
,1.2 Waarom celculturen?
- Handig om intracellulaire processen te bestuderen, bv. proteïnesynthese, signaaltransductie…
- Handig bij het bestuderen van medicijninteracties, cel-cel interacties en genetica.
Geneeskunde:
- Genetische abnormaliteiten door chromosomen te analyseren van bv. vrouwen in verwachting.
- Kwalitatieve en kwantitatieve assays van virale infecties in geïsoleerde celculturen.
Industriële toepassingen:
- Farmacologische en toxicologische effecten van farmaceutische stoffen bestuderen.
- Productie van waardevolle biologische producten.
Bv. virale vaccins, antilichamen, recombinante proteïnen.
1.3 Algemene principes
1.3.1 De Hayflick limiet: senescence
Een celexplantaat is een klein deeltje geïsoleerd weefsel (~ mm³). De explant wordt in een
groeimedium gebracht waarna primaire progenitorcellen zullen uitgroeien. Single cells
vermenigvuldigen tot een samenvloeiende laag (confluent monolayer).
Menselijke cellen uit embryonale weefsels kunnen slechts een eindig aantal x delen in cultuur!
Dus belangrijk om cellen te isoleren voor ze stoppen met de celdeling en beginnen te
verouderen!
Hayflicklimiet
De Hayflicklimiet is het aantal keren dat een normale menselijke celpopulatie zich zal delen tot het
delingsproces stopt en de cel in de verouderingsfase stapt.
CPD: Cumulative Population Doubling
Het aantal Cumulative Population Doubling (CPD) of cumulatieve populatieverdubbelingen is het
aantal keer dat een populatie verdubbeld. Fibroblasten (belangrijke cellen in bindweefsel) stoppen in
cultuur met delen na 50 cumulatieve populatieverdubbelingen.
Factoren die premature veroudering induceren
Er zijn een heel aantal factoren die senescence induceren, voordat de celdeling normaal gezien zou
stoppen. De cel stapt dan vroeger dan normaal in de verouderingsfase.
- Contact met andere cellen (overconfluency)
- Straling
- Oxidatieve stress:
Een stofwisselingstoestand waarbij meer dan een normale fysiologische hoeveelheid reactieve
zuurstofverbindingen in de cel gevormd wordt of aanwezig is. Kan ontstaan door roken,
medicijnen, overmatig alcoholgebruik, overmatige blootstelling aan zonlicht, sporten, obesitas…
,- …
1.3.2 Subculturing
Een subcultuur is een cultuur die ontstaat na subkweken: het opnieuw in cultuur brengen van een
vorige cultuur op nieuw groeimedium. Bij experimenten is het belangrij om steeds te vermelden
welke passage het experiment onderging.
Wanneer?
- Subculturen vòòr volledige confluentie (subconfluentie).
- ± 80% confluentie.
- Te laag: cellen zitten in lag-fase, zullen niet prolifereren (delen).
- Te hoog: cellen kunnen ongewenste veranderingen ondergaan, moeilijk van kweekplaat te halen.
- Volgende keer: opnieuw subkweken bij dezelfde cell density.
Enzymatische digestie: trypsine
- Om cellen te isoleren.
- Bv. met trypsine of trypleE
- Trypsine is een enzym dat cellen van de kweekschaal (culture dish) losmaakt.
- Daarnaast degradeert het de ECM door knippen van peptidebindingen in integrines2.
- Vaak i.c.m. zouten en EDTA. EDTA cheleert de calciumionen in het medium die trypsine
inhiberen.
2
Integrines zijn transmembraanproteïnen die een link vormen tussen de ECM en het cytoskelet.
, 1.3.3 Bepalen van de celviabiliteit
- Dye exclusion methods
- Levende cellen nemen bepaalde kleurstoffen niet op (exclusie), terwijl dode cellen dat wel doen
o.w.v. een defect celmembraan.
- Bv. Trypan Blue
1.3.4 Celkwantificatie
De meest voor de hand liggende methode om celaantallen te bepalen is met
het gebruik van een microscoop en simpelweg te tellen. O.w.v. de grootte en
hoeveelheden van celpopulaties is het nodig om gebruik te maken van speciale
kamers met een gekend volume, bv. een hemocytometer. Een vierkante kamer
met loodrechte lijnen. Het volume van vakjes binnen die lijnen is gekend. Het
gebruik van zo’n tellingen vereist wel een vaste routine: bv. cellen (half) op de
lijntjes tellen niet mee…
Het getelde aantal cellen kan omgezet worden naar het totaal aantal cellen van
een cultuur:
- Cellen/ml = (#getelde cellen)/(#getelde vakjes) x (conversiefactor) x (verdunningsfactor)
- Totaal #cellen = (cellen/ml) x (totaal volume van de celsuspensie)
1.3.5 Primaire culturen vs. continue cellijnen
Primaire celculturen (= explants)
- Cellen direct afgeleid uit weefsels, bv. m.b.v. enzymatische dissociatie.
- Voordelen:
o Behoudt de in vivo karakteristieken van cellen.3
- Nadelen:
o Arbeidsintensief
o Heterogene celpopulaties (kan verschillen bij verschillende culturen opleveren?).
o Gelimiteerde levensduur.
- Voorbeelden:
o Endotheelcellen geïsoleerd uit het endothelium4 van bloedvaten:
Een enkele monolayer, geplaveide morfologie (cobble-stoned).
o Gladde spiercellen uit de middelste laag van een bloedvat:
Uitgerekte, spoelachtige projecties aan beide einden, groeit in verschillende lagen.
Continue cellijnen
- Onsterfelijke cellen zonder veroudering, oneindige levensduur.
- Eén type cellen die spontaan of via transformatie onsterfelijk zijn gemaakt.
o Bv. inductie van oncogenese bij kankercellen (activatie van het telomerase-enzym).
o Bv. door incorporatie van genen in virale vectoren.
- Een nadeel is het verlies van de in vivo karakteristieken.
1. HeLa cellijn: Continue cellijn, afgeleid van Henrietta Lacks haar eierstok-tumorcellen.
3
In vivo: iets dat in het complete levende lichaam van een organisme plaatsvindt.
In vitro: in glas, iets dat na een relatief lange periode buiten het lichaam, in het labo plaatsvindt.
Ex vivo: iets dat plaatsvindt meteen na het isoleren uit het lichaam, iets vers.
4
Het endotheel is een bedekkende eencellig laagje aan de binnenkant van hart, bloedvaten en lymfevaten.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller vdbnick. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.00. You're not tied to anything after your purchase.
