Summary
samenvatting theorie obv inleidingsles
- Course
- Institution
Samenvatting gemaakt op basis van de inleidingsles aangevuld met de informatie in de practicumhandleiding
[Show more]
Seller
Followpakitavanpuyenbroeck
Content preview
Geïntegreerd practicum Biochemie theorieSDH
Ijklijn en calibratie
Kalibratie: aan de hand van een ijklijn
Ijklinn wordt gemaakt door een verdunningsreeks: vertrekken van gekende C verdunningen
Op elke verdunnig wordt de enzym assay toegepast en zo kunnnen we een verband maken
X-as: concentratie , y-as : meting
Normaal gezien krijg je in het practicum een lineair verband regressie
Verdunningsreeks van TTC
Na dithioniet: gaat alle TTC omvormen naar de rode kleur zonder dat er een enzymatische reactie is.
Aceton toevoegen zodat het rood weer in oplossing komt (organisch solvent)
Interpolatie: afleiden van nieuwe datapunten binnen het bereik van gekende datapunten onder aanname van
een zekere relatie tussen die punten
Extrapolatie: “ “ buiten het bereik van gekende datapunten (het verlengen van de rechte)
! altijd eerst corrigeren mbv blanco meting want er zijn in een cel altijd aspecifieke omvormingen van TTC die
niets te maken hebben met SDH
Blanco door substraat hierdoor werkt SDH niet
Ook compensatie nodig voor de verschillende concentraties van organel per ml
TCA: is een zeer sterk zuur en gaat alles protoneren en doen neerslaan zo vinden we het drooggewicht
hoeveel TTC/ gram / tijd
OD : optische dichtheid van een golflengte = maat voor absorptie
1. Waarom aceton toevoegen bij de SDH assay?
Aceton zal de neerslag in de proefbuis oplossen waardoor we de OD-bepaling kunnen uitvoeren.
2. Waarom is het belangrijk het drooggewicht te bepalen?
Zodat we het aantal g weefsel per ml weefselfractie kunnen bepalen.
Celfractionatie
Doel: cellen openbreken maar organellen intact houden
Hoe? : homogenaat in buffer (isotone buffer dus cellen breken niet)
Potter homogenisatie:
- Glazen buis met een teflonstamper
- Past er net in
- Er is nog een kleine ruimte tussen
- Stamper laten draaien
- Door op en neer te bewegen gaan de cellen openbreken door de druk
- Organellen breken niet want die zijn veel kleiner
- Milde manier van homogeniseren
!! wanneer je een cel openbreekt komt volledige inhoud vrij, ook proteasen, deze enzymes gaan bepaalde
andere eiwitten afbreken. Door koeling worden deze geïnhibeerd daarom steeds op ijs werken.
, 3. Waarom gebeurt de weefselfractionatie bij 0 graden in ijs?
Inhiberen van de enzymen en proteases.
Differentiële centrifugatie
- Door G-kracht
- Hoe zwaarder hoe minder G-kracht er nodig is om het
deeltje te doen neerslagen
- Hoe meer toeren, hoe meer G-kracht
Om verder te centrifugeren moet je speciale centrifuges in vacuum
hebben
!! dit is geen 100% scheiding maar wel 90% aanrijking ong
In totaal 4 fracties
SDH Assay
SDH: Succinaat dehydrogenase is een enzym in de mitochondriën die succinaat omzet naar fumaraat en hierbij
TTC T-phenyl tetrazonium chloride (kleurloos) omzet naar Formazan T-phenyl formazan (rood).
Door de kleuromslag kan je de enzymactiviteit bepalen
Doel van het experiment: aantonen dat de citroenzuurcyclus zich afbeeld in de mitochondriën
Cel opsplitsen in verschillende fracties
4. Waarom Na dithioniet toevoegen bij de SDH-assay?
Na dithioniet reduceert TTC waardoor we een ijklijn kunnen opstellen.
5. Wat is de kleuromzetting bij colourometrische kleuring?
Kleurloos TTC zal worden gereduceerd tot een rood wateronoplosbaar Formazan.
LDH isolatie
Wat is LDH? Dit is een isoenzym dat zorgt voor de anaerobe omzetting van pyruvaat naar lactaat en anderom.
Het heeft 5 isovormen. In dit experiment proberen we enkel LDH 5 te isoleren. LDH 5 komt voor in de spieren
en heeft M4 subeenheden. Elke isovorm heeft zijn eigen isoelektrisch punt. Bij LDH 5 is dit 8.44 .
Isoelektrisch punt is de pH waar het aantal + ladingen gelijk is aan het aantal – ladingen dus netto is de lading 0
6. Isoelektrisch punt; wat bindt bij een bepaalde pH?
Bij het isoelektrisch punt is de netto lading van het eiwit 0. Wanneer de pH lager is dan het pI van het eiwit;
netto positieve lading, pH hoger dan het pI van het eiwit, netto negatieve lading.
Zoutprecipitatie
Wat? Eiwitten scheiden op basis van oplosbaarheid
Hoe hoger de zoutconcentratie, hoe lager de oplosbaarheid en dus hoe meer neerslag
- Competitie om de watermantel
- Hoe sterker de mantel gebonden rond het eiwit hoe sneller ze neerslagen
- We gebruiken ammonium sulfaat want dat is een sterk zout
- Wat overblijft in het supernatans zijn eiwitten die niet neerslagen na een (NH 4)2SO4 concentratie van
65%
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller pakitavanpuyenbroeck. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.25. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
80467 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now