Summary
Samenvatting genetica en genomica deel 2
- Course
- Institution
Hier is deel 2 van de samenvatting van het vak genetica en genomica ! Geniet ervan!
[Show more]
Seller
Follow
fienverstappen
Content preview
Samenvatting ZSO 6: genomics: the mapping and sequencing of genomes:1: inleiding (p. 212-213)
-genomica= de wetenschap voor het analyseren en verkrijgen van sequenties van complete genomen
-recombinante DNA technologie= de mogelijkheid om individuele fragmenten van een genoom te klonen en construeren. En
het gekloonde DNA te manipuleren. Dit bevat ook het inplanten en het tot expressie brengen in vreemde cellen.
Waarom?
=> complete blauwprint van het genoom zodat de informatie kan geanalyseerd worden om te bepalen hoe genen en functionele
niet-genen regio’s van het genoom de ontwikkeling en functie van een organisme controleren.
-functionele genomica: biologen doen poging tot het verstaan van hoe en wanneer elk gen in het genoom gebruikt wordt
-comparatieve genomica: biologen vergelijken gehele genomen om de evolutie en fundamentele verschillen tussen soorten te
begrijpen
-kloning= de productie van veel dezelfde kopiën van een DNA molecule door de replicatie in een passende gastheer
=> beschrijvende wetenschap en niet hypothese gedreven wetenschap
2: converting genomes into clones, and clones into genomes (p. 213-225)
-Om een genoom te bestuderen moet het eerst in kleine stukjes worden gekapt.
Deze brengen we vervolgens in passende gecultiveerde gastcellen (E.Coli en gistcel) om veel identieke kopiën te vinden.
=> maken van een fysieke kaart van genoom = map van de chromosomen die ons de posities van belangrijke genen, promotors,
basenparen, sequenties of regio’s die variëren tss individuen aantoont. ( afstand uitgedrukt in bp)
=> om map te maken: bepalen waar deze componenten in het genoom terug te vinden zijn.
=> door kleine fragmenten te re-assembleren in virtueel chromsoom
1: productie van genoombibliotheek = collectie van klonen die op zen minste 1 kopie van elke DNA sequentie in het genoom
bevatten. Het DNA wordt gedragen door kloningsvectoren
kloningsvector= artificieel geconstrueerd DNA molecule dat in staat is om in een gastheercel of organisme te repliceren
2.1: DNA kloning:
- DNA kloning volgt meestal volgende stappen:
1) DNA uit organisme isoleren
2) DNA knippen m.b.v. restrictie-enzymen (= enzym dat specifieke DNA sequentie herkent en knipt)
=> elk individueel stukje in een kloningsvector ligeren, die gesneden is met hetzelfde enzym
=> recombinant DNA molecule (= in vitro gemaakte DNA sequentie die DNA bevat van min 2 verschillende ouders)
3) recombinant DNA in een gastheercel brengen => moleculaire kloning => identieke kopies
restrictie-enzymen/endonucleasen
=> herkent restrictie site ( specifiek nucleotidenpaar waartussen RE knipt) => klieft DNA op/bij restrictie site
=> alle restrictie-enzymen snijden DNA tss 3’ C en fosfaathelft => fragmenten hebben 5’ fosfaat en 3’ hydroxylgroep
=> Toptimum= 37° (= lichaamstemperatuur)
=> Functie: produceren van DNA fragmenten die gekloond moeten worden + analyseren van restrictie sites in stukjes
- partiële vertering= enzym heeft te weinig tijd om zijn job te doen=> sommige restrictie sites gaan geknipt worden en sommigen
blijven ongeknipt
General properties of restriction enzymes
=> meeste restrictie enzymen zijn terug te vinden in bacteriën en slechts een klein aantal in eukaryoten
=> Functie in bacteriën: bescherming GH tegen virussen door viraal DNA uit bacterial DNA te knippen(beschermt zijn eigen
restricte sites met methylering)
=> naamgeving: 3lettercode 1: geslacht 2: soortnaam 3: soortnaam=> additie nummers
=> veel restrictie-enzymen hebben een symmetrieas doorheen het midden
-nucleotide sequentie van 5’-3’ van DNA streng 1 is
hetzelfde als die in 5’-3’ van zijn complementaire
streng
=> tweevoudige rotationele symmetrie
- sommige enzymen herkennen 4, 6 of 8 nucleotiden
sequenties
1
,- Frequency of occurrence of restriction sites in DNA => aantal knips van een enzym maakt in 1 DNA molecule hangt af van het
het aantal keer bepaalde restrictie sites voorkomen.
=> frequentie van een kort nucleotide paar sequentie in het genoom > frequentie van een lang nucleotide paar sequentie
=> de waarschijnlijkheid om 1 van de nucleotidenparen te vinden op een bepaalde positie is onafhankelijk van de
waarschijnlijkheid om een bepaald nucleotide paar op een andere positie te vinden
=> een wijde variëteit van fragmenten resulteren wanneer genoom DNA geknipt is met restrictie enzymen
restriction sites and creation of recombinant DNA molecules
-2 klassen van restrictie-enzymen
1) herkennen DNA sequentie + knippen in DNA sequentie
2) herkennen nucleotidepaar sequentie + knipt 2 strengen van DNA buiten de sequentie => niet bruikbaar voor recombinanten
- klasse 1: knipt op verschillende manieren
a) Small: snijden beide strengen tussen dezelfde 2 nucleotidenparen => DNA fragmenten met stompe(blunt) uiteinden
b) BamHI: maken versprongen knips in de symmetrische nucleotiden-paar sequentie om DNA fragmenten met sticky of
versprongen uiteindes te maken. 5’ of 3’ overhangend => essentieel voor recombinanten (elk DNA fragment hiermee bekomen
heeft dezelfde enkelstrengige nucleotide sequentie op de 2 overhangende uiteindes) => annealing wanneer de 2 strengen weer
bij elkaar komen door DNA ligase ( covalent gelinked)
(DNA ligase verzegelt nicks door fosfodiësterbindingen te vormen
=> ook zij met stompe uiteinden kunnen weer verzegeld worden => wel hoger aantal enzymen
3: cloning vectors and DNA cloning
- meest gebruikte vectoren:
a)plasmiden
b) bacteriofagen (λ en enkelstrengige) en en enkelstrengige) enkelstrengige) en enkelstrengige)
c) cosmiden (vectoren met kenmerken van bacteriofagen en plasmiden)
d) artificiele chromosomen
=> type variërt in de moleculaire aantallen en het maximum aantal van ingevoegd DNA ze kunnen houden.
plasmiden
= extrachromosomale elementen die autonoom in bacteriële cellen reproduceren
=> hebben dubbelstrengig DNA en vaak circulair + antibiotica resistente genen
=> DNA bevat origin of sequences dat essentieel is voor replicatie + genen voor andere functies
=> moeten 3 eigenschappen bevatten (specifiek E.Coli)
1) moet origin of sequences bevatten (essentieel voor replicatie)
2) selecteerbare marker (E. Coli met plasmide makkelijk te onderscheiden van die zonder)
=> selecteerbare marker= gen dat toelaat om makkelijk te zien of de cel wel of niet de cloning vector bevat
=> vaak genen voor resistentie tegen antibiotica ampR tetR
3) het moet 1 of meer restrictie enym klievings sites bevatten => multiple cloning site/ polylinker
=> multiple cloning site= regio van DNA dat verschillende unieke restrictie sites bevat waar vreemd DNA kan ingeplakt worden
=> zit vaak ingebed in gen dat dan verstoorde functie vertoond (blauw-wit kolonie screening)
- insertie:
2
,=>cloning vector wordt geknipt met enzyme dat een site heeft in de multiple cloning site
=> DNA stukje gegenereerd door knippen high molecular weight met zelfde restrictie enzyme => fragmenten variëren in lengte
=> DNA fragmenten worden gemixt met die van de gesneden vector in aanwezigheid van DNA ligase
=> resulterende recombinante DNA plasmide is geintroduceerd in E.Coli bij transformatie
transformatie=proces waarbij nieuwe genetische informatie geïntroduceerd wordt in een cel via extracelullaire stukjes DNA
=> transformatie: probleem: membraan
1) recombinante plasmide incuberen met E. Coli cellen die chemisch behandeld zijn om DNA op te nemen
2) electroporatie: elektrische shock in cel die veroorzaakt tijdelijke ontwrichting membraan => kan erin
=> geplateerd op medium dat ampicilline en X-gal bevat => vorming kolonies: moeten een getransformeerde plasmide hebben
=> identificatie met blauw-witte kolonie screening (LacZ gen)
=> bij ligatie reactie:
=> restrictie verteerde vector kan alleen hercirculariseren (= reactie met 1 DNA molecule=> meer voorkomend dan 2 DNA mol)
=> minimaliseren van recircularisatie d.m.v. behandeling vector met alkaline fosfatase
=> verwijdering 5’ fosfaat, laat 5’ OH groep achter aan 2 eindes van DNA => DNA ligase kan enkel aan 3’ OH aan 5’ fosfaat
hangen
=> insert DNA is niet bewerkt
=> ligatie reactie creërt circulair molecule met 2 nicks waar fosfodiëster ruggegraat gebroken is => houdt vast als 1 molecule
=> alkaline fosfotase maakt identificatie makkelijker plasmide 15kb cosmide: 40-45kb
4: genoombibliotheken
-genoombibliotheek= collectie van klonen die theoretisch ten minste 1 kopie van elke DNA sequentie in het genoom bevatten.
=> niet alle sequenties kunnen gekloond worden => zo veel mogelijk => in kleine fragmenten
FUNCTIE
- genetische analyse
- bestuderen van specifieke kloon
FUNCTIONELE LIMIETEN
1) specifiek gen bevat meerdere restrictie sites en is dus gefragmenteerd in klonen
2) gemiddelde grootte van het fragment is zeer klein (4kb) => zeer groot aantal van recombinant DNA => langdurige screening
3) aantal bp tussen grenzende restrictie sites kan heel groot zijn => sommige fragmenten kunnen niet gekloond worden
=> een deel van het genoom is onkloonbaar omdat ze te groot zijn
4) verlies van informatie => hebben geen idee van hoe de fragmenten aan elkaar waren
=> DNA op verschillende manieren breken zodat overlappingen ontstaan en fragmenten met juiste grootte
(mechanisch of d.m.v. restrictie enzymen) (DNA door injectienaald=> breken=> restrictie-enzymen)
=> kan ook door partiële vertering (tijd en #enzymen beperken) => directe kloning
=> DNA fragmenten sorteren om de juiste te kloneren:
Gel-elektroforese:
1) gel bestaat uit horizontale plaat van agarose en een vloeibare buffer => voegen getande kam toe om putjes te maken
=> gel = zeef => voegen DNA fragmenten toe in putjes => ook ladder DNA (markers => gekende sequenties)
2) elektrisch veld wordt gebruikt om DNA (negatief geladen)te bewegen => DNA beweegt naar positieve pool waarvan de kleine
fragmenten sneller bewegen dan de grotere fragmenten
3) fragmenten zichtbaar maken door ethidium bromide of SYBR toe te voegen
=> binden aan het DNA en gaan uitzenden bij bepaalde golflengte => maakt positie zichtbaar
=> DNA fragmenten vormen banden
4) vergelijking met ladder DNA
=> zie figuur p 223
3
, hoeveel kloons zijn er nodig?
ln (1−P)
N= met N= aantal noodzakelijk P= probabiliteit f= fractionele proportie (zie p 224)
ln (1−f )
5: chromosoombibliotheken
-chromosoombibliotheek= een bibliotheek bestaande uit een collectie van gkloonde DNA fragmenten geleverd van 1
chromosoom (mens: 24 verschillende)
=> flow cytometrie: chromosomen van cellen zijn gekleurd met een fluorescerend kleurmiddel en door een laserstraal
gepasseerd geconnecteerd aan een lichtdetector => sorteren chromosomen op basis van verschillen in kleuringsdensiteit
genoomanalyse: starten met genoombibliotheek en klonen vervolgens sequenties om gehele sequentie te bepalen
6: DNA sequencing en analyse van DNA sequentie (p. 225-226)
- kloon kan geanalyseerd worden om de nucleotide sequentie te bepalen van het ingeplakte DNA of de distributie en locatie van
restrictie-enzymen
BRUIKBAAR VOOR:
- hoe gerelateerd zijn 2 organismen
- identificatie van genen sequenties
-…
sequencing
= methode van DNA sequencing
=> gebaseerd op DNA replicatie en gebruikt een sequentie die al gekloond en ingeplakt is als template
=> DNA polymerase voegt nucleotiden toe op korte primer tot de extensie stopt door inclusie van gemodificeerd nucleotide
=> kleine fragmenten die door gelelektroforese bepaald kunnen worden
1) denaturatie van dubbel streng door temperatuurstoename
2) additie van oligonucleotide (=primer) aan 1 van de 2 strengen (10 à 20 nucleotiden lang)
=> 3’ einde van primer is naast DNA sequentie die we willen bepalen
=> DNA polymerase zal vanaf primer complementaire basen aanhechten in 5’-3’
3) DNA polymerase hecht nucleotiden => deoxynucleotide precursoren (dNTP’s) aan complementaire streng toe
=> dit proces = sequencing
DIDEOXY:
- geautomatiseerde DNA sequencer die gedigitaliseerd is:
1) denaturatie van dubbel streng door temperatuurstoename
2) additie van oligonucleotide (=primer) aan 1 van de 2 strengen (10 à 20 nucleotiden lang)
=> 3’ einde van primer is naast DNA sequentie die we willen bepalen
3) toevoegen van DNA polymerase en dNTPS en ddTPS = dideoxynucleotides (3’ H ipv 3’OH met fluorescente moleculen)
=> emitteren bij verschillende golflengten=> ddGTP=blauw ddATP=groen ddCTP=anders groen ddTTP=geel,meer dNTP dan
ddNTP => ddTPs stoppen de aanhechting van nucleotides
=> productie van groot aantal nieuwe DNA fragmenten met verschillende grootte
=> DNA fragmenten bepaald door een speciaal type van gelelektroforese
=> computer analyseert kleine kleurverschillen met laser
=> voor langer: verschillende malen met overlappende sequenties
- we gebruiken een geautomatiseerde DNA sequencer (in computer zetten)
zie figuur 9a p 226 + figuur p 228
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller fienverstappen. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $6.96. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
53022 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now