Identificatie, karakterisatie en kwantificatie van biomoleculen
Institution
Universiteit Antwerpen (UA)
Dit is niet echt in de vorm van een samenvatting maar eerder als cursus geschreven. Het bevat alle informatie van de slides op een overzichtelijke manier maar ook de extra informatie die de prof Patrick D'Haese die hij in de lessen heeft verteld.
Identificatie, karakterisatie en kwantificatie van biomoleculen
All documents for this subject (25)
1
review
By: lima6 • 2 year ago
Seller
Follow
UABMW2000
Reviews received
Content preview
Hoofdstuk 1
Biochemische analyse
Analytische performantie
Aard van de analyse
Een kwalitatieve analyse beoogt de identificatie, de detectie en/of aantonen van bestanddelen in een
preparaat of staal. Kwantitatieve analyse beoogt dan weer eerder het inwinnen van informatie
omtrent de relatieve hoeveelheid zoals concentratie van een, meerdere of alle bestanddelen
aanwezig in de te analyseren materie. Indien men alle bestanddelen bestudeerd is het een
totaalanalyse en als het meerdere zijn maar niet alles is het een partiële analyse. Een kwalitatieve
analyse berust op een meting van een fysische of fysicochemische grootheid die rechtstreeks of
onrechtstreeks evenredig is met de hoeveelheid. Voorbeelden zijn volume, gewicht, stroomsterkte,
potentiaal, geleiding, massa, radioactiviteit, lichtabsorptie, emissie of fluorescentie.
Zes parameters van de analyse
Resultaten van een biochemische analyse moeten voldoen aan bepaalde parameters.
- Specificiteit
Zo zal men moeten nagaan hoe specifiek de proef moet zijn. Als we slechts een eiwit willen
analyseren hebben we een selectieve methode nodig. Een reactie is specifiek, wanneer ze enkel en
alleen maar opgaat met het bestanddeel dat men wenst te doseren. De specificiteit van een test kan
eventueel verbeterd worden door aanpassen van een aantal parameters zoals pH, complexvorming,
temperatuur, oxidatiegraad, filteren van interfererende factoren. Stel dat je een bepaald enzym wil
testen en alleen dat enzym moet de test 100 procent specifiek zijn.
- Selectiviteit
Dit is het tegengestelde van specificiteit. Een test is selectief wanneer hij een bepaalde, evenwel
geen absolute voorkeur vertoont voor het te doseren bestanddeel maar ook positief kan reageren
met een aantal andere componenten. Dit is als we bijvoorbeeld al het eiwit in een staal wensen.
- Sensitiviteit
Dit is de gevoeligheid van een methode en deze wordt bepaald door de helling van de ijkcurve wat
een meetsignaal is ten opzichte van de concentratie. De gevoeligheid is het gemeten signaal/
concentratie. Dit is dan het signaal per eenheidsconcentratie. Hoe steiler de richtingscoëfficiënt van
de ijklijn, hoe hoger de sensitiviteit. We zetten de meetsignalen uit tegenover de concentratie
waarbij het signaal verkregen wordt.
Voor bepaalde technieken wordt ook de term karakteristieke concentratie als maat voor
gevoeligheid. Dit wordt uitgedrukt in gram. Dit is de hoeveelheid van de te bepalen stof die een
absorbantie van 0,0044 of 1 procent absorptie teweegbrengt. Gepubliceerde gevoeligheidswaarden
zijn een uitstekende referentie voor het afstellen en kalibreren van de apparatuur en/of het
controleren of de analyse betrouwbaar is; i.e. komt bij een gekende gevoeligheid de hoogte van het
signaal van de standaarden overeen met het vooropgestelde analyseresultaat? Dit is nodig om te
zien of er een goede methode hebt.
, - Detectielimiet of de LOD
Dit is de kleinst mogelijke concentratie die een toestel kan meten om zo een significant verschil te
verkrijgen dat het dubbel is van de achtergrondruis. Dit is dus de concentratie die een ratio heeft van
signaal op ruis van 2 en is samen met de quantificatielimiet een van de belangrijkere parameters. Dit
is belangrijker dan sensitiviteit aangezien het ook het achtergrondsignaal in rekening brengt. Soms
gebruiken we ook de formule 3 maal SD. De detectielimiet en de gevoeligheid zijn niet gelijk want ze
gebruiken andere parameters. De kwantificatielimiet of LOQ is de laagste concentratie van de te
bepalen stof die kwantitatief kan worden bepaald en meestal gelijk is aan 10 keer SD blank signaal.
Dit is dus strenger.
De sensitiviteit is
gelijk door gelijke
concentraties. De
signaalruisverhouding
maal 2 is veel beter
door B.
- Precisie en accuraatheid
Precisie is een maat voor de reproduceerbaarheid van de resultaten. wordt bepaald door de
verhouding van standaarddeviatie op gemiddelde waarde. Deze is een maat van imprecisie. Dit is dan
de variantiecoëfficiënt (VC) die uit twee onderdelen bestaat namelijk de intra VC en de inter VC. De
inter VC is de belangrijkste! Als de intra VC goed is, moet men nog nagaan of de inter ook volstaat.
De intra VC is de gemiddelde afwijking ten opzichte van het gemiddelde tijdens een gelijke
analytische run onder dezelfde condities. Men doet bijvoorbeeld een zelfde experiment 20 keer na
elkaar. De inter VC is de gemiddelde afwijking ten opzichte van het gemiddelde bij verschillende
operatoren, verschillende loten van reagentie.
Accuraatheid is de maat voor de afwijking van het experimenteel gevonden resultaat ten opzichte
van de werkelijke waarde. Meestal stellen we de maximale afwijking bij 5 procent. Teneinde de
accuraatheid van een bepaalde analysemethode te bepalen kan men zich baseren op het analyseren
van met certificaat voorziene standaardmonsters afgeleverd door standaardinstituten. Dit is niet
altijd beschikbaar en ook zeer duur. Een indirecte benadering van de accuraatheid bestaat erin de
recovery van een gekende hoeveelheid geaddeerde te meten substantie te bepalen.
Dit zijn twee verschillende zaken en het is belangrijk dat beide bepaald worden bij verschillende
concentraties.
,De middelste is optimaal omdat de VC zo laag mogelijk hoort te zijn. De SD zal stijgen maar de
verhouding tussen concentratie en SD blijft gelijk dus dit is de ideale toestand.
- Blanco
Dit is de bepaling van de fractie van het totaalsignaal dat niet te wijten is aan het te doseren
bestanddeel in het te analyseren staal. Een voorbeeld zien we in de spectrofotometrie zoals de
absorptie bijdrage van solvent en reagentia. Ook bij enzymdoseringen zien we de bijdrage van
spontane hydrolyse van substraten. Het gaat dus over afwezigheid van het enzym bijvoorbeeld en
dan zien welk signaal we krijgen. Dit is een signaal dat niet te wijten is aan het te onderzoeken
substraat.
De helling van het lineaire deel is de
gevoeligheid. Het dynamisch bereik
loopt tot wanneer het lineair domein
afvlakt en dit is concreet tot het LOL
of de limit of linearity. LOD ligt op 2
keer de ruis en LOQ op 10 keer de
ruis.
Kwaliteitscontrole van de biochemische analyse
Dit is om te zien of een methode goed en voldoende is voor de analyse. Men weet niet zeker of de
kwaliteit van de proef behouden blijft.
, Kwaliteitscontrole laboratoriumanalyses
Control charts
Bij de eerste zien we een
goede controle. De donkere
lijn is de gemiddelde waarde
en de stippellijn geeft weer tot
hoever de afwijking mag
lopen. Men meet van een staal
met gekende concentratie de
concentratie op andere
tijsstippen. Bij de tweede zien
we dat de waarden wel bij
elkaar liggen maar het
gemiddelde verschoven is. Bij
de derde zien we een gelijk
gemiddelde maar wel veel
afwijking.
Extern
Dit wordt veel georganiseerd door andere laboratoria. Zo hebben we het Trace Element Quality
Assessment Programme in de UK dat spoorelementen opspoort. Men kan stalen sturen naar een
onafhankelijk labo. Dit bestaat uit drie stalen per maand met ongekende concentraties van de te
analyseren compound gedurende zes maanden. Ieder staal wordt twee keer toegestuurd op
ongekende tijdsstippen en men krijgt zes maandelijkse rapporten. De analytische performantie
gebeurt op basis van:
- Recovery geaddeerde compound wat een maat is voor accuraatheid
- Afwijking ten opzichte van het consensus gemiddelde wat ook een maat is voor accuraatheid.
Het consensusgemiddelde is het gemiddelde van alle deelnemende laboratoria.
- Verschil tussen in duplo analyses wat een maat voor precisie is.
Kalibratie van biochemische analyse
Hier zal het gaan over het vormen van een standaard die afhankelijk is van de analyse. We hebben
externe kalibratie en interne kalibratie. Onder dat laatste vallen standaardadditiemethode,
additiekalibratiemethode, methode van de inwendige standaard. Indien we een complexe matrix
hebben die nog uit andere bestanddelen bestaan die we niet willen onderzoeken zoals bloed moet je
via interne kalibratie zorgen dat de andere componenten die kunnen interfereren geen resultaat
geven.
De kalibratiefunctie is de relatie tussen tussen het door de apparatuur gegeneerde signaal y en de
concentratie van het te bepalen bestanddeel x. Uit de omgekeerde functie van de meetfunctie kan
de concentratie van het te meten bestanddeel bepaald worden op basis van het bekomen signaal x =
fI(y). Deze functies worden bekomen door meting van een aantal stalen met gekende hoeveelheid
van het te bepalen bestanddeel namelijk de kalibrators.
Men onderscheidt externe en interne kalibratiemethoden
- Externe kalibratie kan worden toegepast wanneer het bekomen signaal niet onderhevig is
aan matrixeffecten (bv. analyse van een bepaalde component in biologisch materiaal (vb
serum) tov waterige standaarden/calibrators).
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller UABMW2000. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $6.96. You're not tied to anything after your purchase.
