Other
Biochemische Laboratoriumtechnieken
- Course
- Institution
Samenvatting Biochemische Laboratoriumtechnieken Deel 2: Elektroforese
[Show more]
Seller
Follow
amberdams
Reviews received
Content preview
1 Basisprincipes elektroforese1.1 Inleiding
1.1.1 Definitie
Elektroforese= Beweging elektrisch geladen deeltje in een elektrisch veld. Als ≠ deeltjes in dit veld
met een ≠ snelheid migreren → gescheiden.
Zone-elektroforese= Monster wordt in een specifieke zone aangebracht, waardoor de zones na
elektroforese opsplitsen in verschillende zones:
Elektroforetische migratie
Diffusie: zones verbreed (migratiesnelheid is niet voor alle deeltjes gelijk)
Convenctie: zones vervormd (verhoging migratiesnelheid= meegaan migratierichting)
1.1.2 Elektroforetische migratie
Krachten die op deeltje inwerken:
1. Elektrische kracht → snelheid waarmee deeltje beweegt in elektrisch veld neemt toe
2. Wrijvingskracht → naarmate snelheid stijgt, stijgt aantal botsingen
Op bepaald moment: elektrische kracht = wrijvingskracht
1.1.2.1 Veldsterkte (E)
∆𝑈 ∆𝑈= spanning in V
E=
∆𝑥 ∆𝑥= afstand in m
Meestal ligt afstand vast, zodat veldsterkte enkel gewijzigd kan worden door de spanning te wijzigen.
1.1.2.2 Elektrische kracht (Fq) E= veldsterkte
Fq = E . Q Q= lading deeltje
De kracht die uitgeoefend wordt op een geladen deeltje in elektrisch veld.
1.1.2.3 Wrijvingskracht (Ff) f= wrijvingscoëfficiënt
Ff = f . v v= snelheid deeltje
f is afhankelijk van grootte/vorm deeltje en de viscositeit van de oplossing.
1.1.2.4 Migratiesnelheid (v)
𝐸.𝑄
v= 𝑓
(Fq = Ff → deeltje beweegt met een constante snelheid)
1.1.2.5 Mobiliteit (m)
𝑣 𝑄
𝑚= =
𝐸 𝑓
1.1.2.6 Migratie van bolvormige deeltjes
𝑓 = 6. 𝜋. 𝑅. 𝑛
𝐸. 𝑄
𝑣=
6. 𝜋. 𝑅. 𝑛
𝑄
𝑚=
6. 𝜋. 𝑅. 𝑛
AD Biochemische technieken - Deel 2: Elektroforese 1
,1.1.2.7 Invloeden van mobiliteit
Mobiliteit van biomoleculen is in functie van:
- pH: beïnvloedt ladingverandering en conformatieverandering
- Temperatuur: beïnvloedt de viscositeitsverandering en lading
- Invloed van watermantel en ionensterkte
o Straal altijd groter dan in werkelijkheid, omdat watermantel rond het deeltje zit
→ mobiliteit lager
o Q altijd lager (afscherming deeltje) → mobiliteit lager
Actuele mobiliteit mobiliteit van het deeltje in de oplossing
Absolute mobiliteit mobiliteit van het deeltje wanneer de andere componenten 0 zijn
mobiliteit van de component als geheel, waarbij deze component
Effectieve mobiliteit
verschillende vormen kan hebben. 𝑚𝑒𝑓𝑓 = ∑ 𝑥𝑖 . 𝑚𝑖
Voorbeeld: azijnzuur CH3COOH CH3COO- + H+ → pKa= 4,76
[𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂𝐻] (𝑧𝑢𝑢𝑟)
pH = pKa – log [𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂−] (𝑏𝑎𝑠𝑒)
[𝑪𝑯𝟑𝑪𝑶𝑶𝑯]
4,76 = 4,76 – log [𝑪𝑯𝟑𝑪𝑶𝑶−] moet 1 zijn → 50% CH3COOH → geen mobiliteit, geen lading
→ 50% CH3COO- → effectieve mobiliteit (ioniserende vorm)
1.1.3 Diffusie
= bepaalde richting, gevolg van concentratieverschillen in een oplossing.
Diffusiecoëfficiënt= eigen aan een molecule. D= (k.T)/6𝜋R
Als T stijgt → stijgt diffusie
Als R stijgt → daalt diffusie (grotere deeltjes diffunderen trager)
Voorzorgen tegen diffusie:
- Lage temperatuur
- Elektroforese zo kort mogelijk
- Na lading, staal zo snel mogelijk laten lopen
- Kleine moleculen zijn problematisch
1.1.4 Convectie
= een bepaalde richting, gevolg van drukverschillen in een oplossing.
1.1.4.1 Elektro-endosmose
pH groter dan 3 → glas geeft kationen (+) af. Kationen omringt met
watermoleculen migreren naar kathode (-) → vloeistof stroomt.
Anionen (-) in glaswand worden aangetrokken tot de anode (+),
maar dit gaat niet, want zitten vast in glaswand → geen migratie.
Te scheiden anionen vanuit de oplossing (midden tekening) gaan wel
migreren naar anode.
Probleem: anionen worden tegengewerkt door de vloeistofstroming
𝜀 ..𝐸 → hoe meer ionen afgestaan door glaswand, hoe hoger zetapotentiaal en elektro-
𝑣=
endosmosesnelheid
Zetapotentiaal= potentiaalverschil tussen de negatieve anionen in de glaswand en de positieve
kationen in de oplossing. Daalt bij een stijging van de ionensterkte in de oplossing.
AD Biochemische technieken - Deel 2: Elektroforese 2
, Praktisch:
Agarose gel: hierop zitten sulfaatgroepen met een negatieve lading met een tegenion natrium →
Natrium ionen kunnen eraf → migreren naar kathode → vloeistofstroming naar kathode.
DNA (negatief geladen) migreren naar anode, maar door natriumionen (vloeistofstroming naar
kathode) wordt DNA tegengehouden.
1.1.4.2 Capillaire krachten
Zorgen ervoor dat de bufferoplossing op alle plaatsen hetzelfde blijft. Door verdamping kan deze
verschillen en moet deze aangepast worden.
1.1.4.3 Drukverschillen
Ontstaan door verschillen in dichtheid in het gel.
Gevolg van:
- Verschillen in T en samenstelling oplossing
- Hoogteverschil tss niveau van buffervaten bij horizontale elektroforese
- Temperatuurverschillen in gel
- Drukverschillen in medium
1.1.4.4 Temperatuurverschillen
Leiden tot verschillen in dichtheid en verdamping → vloeistofstroming
Wat doen om convectie te vermijden:
- Goede koeling van matrix
- Homogene gel
- Opgelet bij horizontale gels → gelijke vloeistofniveaus in buffervaten
- Matrix met zo laag mogelijk elektro-endosmose getal
1.1.5 Warmte ontwikkeling
Probleem als T stijgt want dan stijgt mobiliteit, diffusie en convectie → beperken van de warmte
ontwikkeling.
Hoe:
1. Potentiaal verschil verlagen zodat de migratiesnelheid verlaagt. (daling veldsterkte)
Potentiaal verschil verlagen → verhoogde diffusie
2. I (stroomsterkte) daling indien een laag geleidend vermogen (enkel mogelijk bij grote
buffercomponenten)
3. Koeling: submariene: verdamping beperken.
Bij PAGE eventueel koelen via buffer
Blotting: koelelementen toevoegen aan elektroforesekamer
Iso-elektrisch foccusering (IEF): koelplaat met dunne gel op plastiek folie
1.2 Experimentele aspecten
1.2.1 Matrix
1.2.1.1 Soorten
- Cellulose-acetaat
- Agar
- Agarose en polyacrylamide → meest gebruikt voor EW en NZ elektroforse
AD Biochemische technieken - Deel 2: Elektroforese 3
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller amberdams. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.05. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
78075 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now