Summary
Samenvatting Moleculaire biologie theorie (MBT)
- Course
- Institution
Samenvatting Moleculaire biologie theorie (MBT)
[Show more]
Seller
Follow
jillspaander
Reviews received
Content preview
MBT samenvattingHoorcollege 2 =>
Wat doet een PCR ?
Vermeerderd (amplificeert) een specifiek stuk DNA.
Waarom doe je een PCR ?
- Aanwezigheid van een gen of andere sequentie aantonen. ( bijv. identificatie van personen
en forensisch onderzoek )
Forensisch PCR : hoeveelheid repeats aantonen in variabele DNA regio’s -> per persoon verschillend.
- Promotor, gen of andere genetische onderdelen te kloneren. ( bijv. fundamenteel onderzoek
naar functie van DNA sequenties)
PCR + input DNA -> Agarose gel electrophoresis -> UV visualisation -> The final product
Waarop is de PCR techniek gebaseerd ?
DNA replicatie in de cel ( in vivo)
- Enkelstrengs DNA maken = helicase
- DNA polymerase bindt door primase en repliceert het DNA.
- DNA polymerase beweegt over het DNA van 3’naar 5, maar maakt nieuw DNA van 5’naar 3’.
Waarmee maak je een PCR reactie specifiek ?
Door de primers die op specifieke locaties binden.
96 graden
Kan tegen hoge
temperaturen
Wat heb je nodig bij PCR ?
- PCR machine (thermal cycler)
- PCR reactievaatjes
- PCR reactiemengsel : DNA (template),
twee primers, nucleotiden, Taq
polymerase en buffer.
- Analyse systeem : bijv. agarose gel
Drie stappen PCR :
= Enkelstrengs DNA maken. (96 graden)
= Plakken primers ( 50-65 graden)
= Verlengen primers ( 72 graden)
Elke cyclus verdubbelt het PCR product.
Vaak 30-40 keer herhalen.
Bij stap 0 extra denatureren = voor genomische DNA.
Ontwerpen van primers
- Korte stukjes enkelstrengs DNA (17-28 nt)
, - Andere naam : ‘Oligo’
- Synthetisch te maken, opgebouwd uit G,A,T en C
- Elke sequentie te maken
- Specifiek
De kans dat 1 base specifiek kan binden = ¼ , er zijn namelijk 4 nucleotiden.
- Dus wanneer je een primer hebt van 4 nucleotiden is de kans ( ¼ ) 4 dat het specifiek kan
binden. Om de 256 basen kan de primer binden.
Een primer is 20 nucleotiden lang, omdat deze primer statistisch minder dan 1 keer ergens in het
humane genoom kan binden. ( Humaan genoom = 3*10 9 )
Algemene regels voor primer design
- 3’-end G of C -> Deze nucleotiden zijn sterker, omdat ze 3 waterstofbindingen bevatten.
- 17-28 bp
- 40-60 % GC -> zorgt voor een goede annealing temperatuur.
- Voorkom primer dimeren -> samengevoegde forward en reverse primer.
- Voorkom interne “self-annealing”
- Tm (smelttemperatuur) tussen 55 en 70 graden -> waterstofbindingen verbreken, 50 % van je
primers bindt nog. ( primers van DNA afsmelten)
Berekening smelttemperatuur ( Tm )
Voor 15-25 basen
Tm = 2 (A + T) + 4 (C + G) Grove schatting!
Tm 50 % is gebonden (ds) 50 % los (ss)
Je wilt dat alle primers gebonden zitten = annealing temperatuur (Ta)
Dus Ta = Tm – 5 graden
Voor een PCR heb je 2 primers nodig. Reken van beide de Ta uit en de laagste Ta is de
temperatuur die je in de PCR reactie gebruikt. Beide primers moeten kunnen binden.
Te lage annealing temperatuur zorgt voor foutbindingen doordat de primers niet afsmelten, hierdoor
ontstaan meerdere aspecifieke producten.
Extensie = bij elk PCR protocol is de tijd anders, dit omdat het afhangt van de grote van het
product.
Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) :
- 72 graden optimale synthese temperatuur
- Hittestabiel
- Geen proofreading activiteit
- 1 kb/ min
Proofreading verwijdert fouten basen die ingebouwd zijn door middel van exonuclease activiteit (3’->
5’) worden ze verwijdert door de polymerases zelf.
- Niet alle polymerases hebben dat. (Zoals Taq)
- Polymerases zijn door proofreading langzamer, maar maken veel minder fouten.
, Template DNA
- Meestal wordt DNA gezuiverd ( je weet dan de zuiverheid en de hoeveelheid)
- Geen remmers van DNA polymerase ( bijv. Heem groep)
- Target bereikbaar voor primers en Taq
- Geen EDTA ( of een hele lage concentratie hiervan) : Mg 2+
- Niet teveel fragmentatie/afbraak
- Niet te vaak vriezen/ontdooien
Factoren die degradatie van DNA bevorderen : Te veel degradatie = geen PCR mogelijk
Tijd, temperatuur, vochtigheid, licht (UV) en blootstelling aan chemicaliën.
Hoorcollege 3 =>
Kloneren van DNA = knippen en plakken
Waarom kloneren ?
Manipuleren van DNA om :
- Eiwit in grote hoeveelheden te produceren.
- Functie van genen of domeinen van genen te onderzoeken.
- Effect van gen mutanten bestuderen.
- Wanneer is een promotor actief?
- Eiwit fluorescent maken en lokalisatie volgen.
5 stappen van kloneren :
1. Digestie : DNA ( plasmide of een PCR product) met restrictie-enzym(en) knippen.
2. Ligatie : DNA fragment in het plasmide inbouwen
3. Transformatie : de plasmiden worden opgenomen door de bactieriën.
4. Identificatie van de juiste bacterie met het juiste fragment
- Sommige bacteriën nemen niets op, en sommige bacteriën nemen een verkeerd (leeg)
plasmide op.
5. Vermenigvuldigen : opkweken van de juiste bacterie.
Gebruik RE om DNA te knippen en om plasmide te lineariseren.
Restrictie enzymen :
- Enzymen die DNA aan specifieke sequenties binden en de suiker-fosfaatketen verbreken
(endo-nuclease).
- Oorspronkelijk betrokken in bacteriën en archaea bij afbraak van viraal DNA.
- Vele geïdentificeerd.
- Vele zijn commercieel verkrijgbaar.
Type II RE : herkennen palindroom (reverse complementair), en knippen in een 4-8 bp grote
palindroom sequentie.
- Type II endonucleases zijn homodimeren.
- Type II RE geven sticky-ends (stukje
enkelstrengs DNA) of blunt ends.
5’overhang -> eindigt met 5’ en andersom.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller jillspaander. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $6.40. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
56326 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now