Summary
Samenvatting Gentherapie, kanker en aids - Zelfstudie deeltentamen 1
- Course
- Institution
Aantekeningen voor alle hoorcolleges Gentherapie, Kanker en Aids voor deeltentamen 1 (2019/2020)
[Show more]
Seller
Follow
FFV
Reviews received
Content preview
Gentherapie, Kanker en Aids – ZelfstudieArtikel 1: The Molecular Machines that Control Genes
Het genoom van elke cel bestaat uit 150.000 genen. Elk celtype gebruikt een subset van deze genen
om specifieke eiwitten te produceren. De motor die transcriptie drijft is in vrijwel elke cel hetzelfde
en bestaat uit 50 eiwitten.
Het eerste onderzoek naar transcriptie is gedaan in bacteria en andere simpele eencellige. Hier
volgde uit dat genen eigenlijk verdeeld zijn in twee gebieden: de coderende regio en een regulerende
regio. De regulerendee regio, ook wel de promotor, ligt 10 nucleotiden van de start van de
coderende regio. De hoeveelheid RNA is afhankelijk van de snelheid waarmee de RNA-polymerase
bindt aan de promotor en transcriptie initieert.
RNA-polymerase heeft in bacteria de sigma factor nodig om aan de promotor te binden. Door deze
sigma factor worden alle niet-promotor sequenties makkelijk genegeerd.
In 1983 zijn er drie discrete nucleotide sequenties gevonden die de eukaryote polymerase lijken te
controleren. Een van deze regios, de core promotor lijkt sterk op de promotor van de bacteriën en
ligt dicht bij de coderende sequentie. Bij de core promotor begint de polymerase.
Enhancer sequenties fasciliteren de transcriptie. Deze bevinden zich wel duizende nucleotiden
downstream van de core promotor. Silencers inhiberen de transcriptie en bevinden zich ook vele
nucleotiden weg van de core promotor. Er zijn geen twee genen die precies dezelfde samenstelling
van enhancers en silencers hebben. Hierdoor kan de transcriptie voor elk gen individueel gereguleerd
worden.
Enhancers en silencers kunnen an sich de activiteit van RNA-polymerase niet controleren, het zijn dus
docking sites voor andere eiwitten. De activators en repressors brengen de informatie van de
enhancers en silencers over naar de polymerase.
Het eerste humane transcriptie factor die gevonden was bleek te binden aan de CG-box (een
enhancer). Als RNA-polymerase wordt toegediend, dan bleek de hoeveelheid van eiwitten met
specifiek een CG-box dramatisch toe te nemen. Deze eerste humane transcriptiefactor werd speci-
ficity protein 1 (Sp1) genoemd.
Een van de grootste problemen met het vinden van transcriptiefactoren was dat deze eiwitten maar
in heel kleine hoeveelheden voorkomen in de cel. Dit werd opgelost door het produceren van
kunstmatige sequenties die aan een bead verankerd werden. Enkel de specifieke transcriptiefactoren
zullen nu binden en kunnen zo geïsoleerd worden.
Het ene gebied van Sp1 vouwde in drie ‘’zinc fingers’’. Deze zijn gebogen rond een zink atoom en
dienen als een soort haakjes om activator eiwitten aan het DNA te verbinden. Het andere Sp1
domein bleek enorm veel glutamine te bevatten. Sp1 eiwitten zonder dit domein konden wel aan
DNA binden maar hadden geen effect op de transcriptie. Achteraf bleek het glutamine domein een
activatie domein te zijn wat interacteerde met vele andere eiwitten.
In 1980 werd er door Roeder gevonden dat RNA-polymerase in eukaryote cellen alleen kan werken
als er meerdere andere transcriptiefactoren aanwezig zin, de basale transcriptiefactoren, die ook
verzamelen rond de core promotor. In principe volstaan deze basale transcriptiefactoren in het
activeren van de polymerase, maar er is nu geen controle op de snelheid en de snelheid was erg laag.
De snelheid waarmee de transcriptie verloopt wordt dus bepaald door de activatoren en de
repressoren. De activatoren zijn nodig om het basale complex te assembleren.
,Het glutamine rijke domein van Sp1 bond aan TFIID, waardoor deze makkelijker aan de promotor
werd gezet. Factor D blijkt de enige basale transcriptiefactor te zijn die DNA bindt en is dus ook de
transcriptiefactor die begint met het assembleren van het complex. TFIID bindt aan de TATA-box
sequentie in de core promotor.
TFIID werd het eerst puur geïsoleerd uit gist cellen. Het eiwit wordt ook wel TBP (TATA-binding
protein) genoemd en bindt enkel aan deze sequentie. Later bleek dat TFIID naast TBP ook nog andere
domeinen had. Deze domeinen waren niet nodig voor TFIID om alleen de polymerase te activeren,
maar waren essentieel voor de regulatie door andere transcriptiefactoren. Deze domeinen werden
vanaf toen co-activators genoemd: ze konden zelf niet binden aan DNA en waren ook niet essentieel
voor transcriptie.
In 1990 suggereerde Pugh dat de coactivators diende als een soort adaptor moleculen. Deze zouden
bindingsplaasen hebben voor de activatoren en droegen zo bij aan het assembleren van de basale
machinerie. Deze ideeën werden niet altijd ondersteund omdat er nog geen co-activatoren
geïsoleerd waren.
De coactivator hypothesis werd eindelijk ondersteund toen pure kopiën van TFIID geïsoleerd konden
worden. Hieruit bleek er naast TBP ook 8 andere subunits te zitten, deze werden TBP-associated
factors (ook wel TAFs) genoemd.
Sp1, in combinatie met basale factoren en RNA-polymerase bleek tot een verhoogde transcriptie te
lijden als de TAFs werden toegediend.
Later bleek dat verschillende transcriptie activatoren bleken te binden aan verschillende TAFs. De co-
activatoren in TFIID bleken een soort van verwerkingscentrum te zijn voor regulatoire signalen vanuit
de DNA gebonden activatoren.
De complexen van activatoren, co-activatoren en de basale machinerie dienen voor het aantrekken
van RNA-polymerase naar specifieke genen op specifieke snelheden.
De koppeling van activatoren aan enhancers zorgt voor het buigen van het DNA waardoor deze dichtr
bij elkaar en bij de core promotor komen. Hierdoor kunnen activatoren aan co-activatoren koppelen
zodat TFIID op de promotor kan binden. Hierdoor kan uiteindelijk het complete basale complex
gevormd worden, waardoor uiteindelijk RNA-polymerase kan binden.
Repressoren zouden kunnen werken door ook te binden aan co-activatoren waardoor er geen plaats
meer is voor de binding van activatoren. Daarnaast zouden ze aan activatoren kunnen binden zodat
deze niet meer kunnen binden aan enhancers.
Cellen verschillen in de eiwitten die ze maken doordat ze verschillende samenstellingen van
activatoren en repressoren hebben.
Door activatoren te blokkeren zou je niet-gewilde transcriptie kunnen voorkomen, of je zou de
machinerie juist kunnen stabiliseren als je wel genexpressie wilt.
HIV werkt bijvoorbeeld door de virale transcriptiefactor TAT. Als TAT geïnhibeerd kan worden, zou dit
virus misschien onderdrukt kunnen worden.
Daarnaast zou hypercholesterol voorkomen kunnen worden als de transcriptie van LDL-receptoren in
de lever cellen verhoogd wordt.
Artikel 2: The New Genetic Medicine
Door drugs te maken die precies in de active site van een eiwit past zou je een specifieke drug
(zonder bijwerkinegn) krijgen, elke active site verschilt namelijk. De triplex en antisense methoden
zouden op een specifieke plek in het DNA of RNA binden. De triplex approach is gericht op DNA, de
antisense approach is gericht op mRNA. Hierdoor zullen de nadelige eiwitten uberhaupt niet
geproduceerd worden.
, DNA-oligonucleotiden of oligomers: korte strengen van DNA-nucleotiden. DNA-nucleotiden zijn hier
geschikt voor omdat de regels waarmee deze aan elkaar gaan zitten goed begrepen zijn. Hierdoor
kunnen ze met hoge specifiteit geproduceerd worden. Omdat het in feite om hele kleine stukjes DNA
gaan, worden deze therapieën ook wel genetische therapieën genoemd. Dit verschilt wel van
gentherapie omdat hier geheel nieuwe en gezonde eiwitten gevormd kunnen worden.
Oligonucleotiden kunnen enkel de expressie van bestaande eiwitten blokkeren. De oligos moeten
minimaal 15 nucleotiden lang zijn om effectief aan hun target site te binden, en non-target binding te
voorkomen.
Bij de triplex approach wikkelt het oligomeer zich rond de bestaande helix waardoor een triplex
strand gevormd wordt.
Bij de antisense approach bindt de oligomeer aan de mRNA (sense) strand. Hierdoor wordt de
translate verstoord waardoor de sense strand niet kan worden omgezet in een eiwit. Antisense
oligomeren zijn handiger dan hele antisense genen omdat deze makkelijker de cel in komen.
Antisense werkt op twee manieren:
1. Ze verstoren het vermogen van de cel om het ‘sense’ RNA te lezen.
2. Ze stimuleren ribonuclease H om het RNA te binden en klieven.
In 1978 wordt een oligomeer van 13 nucleotiden ontwikkeld die interfereert met het mRNA van het
Rous sarcoma virus. Hierdoor werd de replicatie van dit virus geblokkeerd.
In 1980 is gevonden dat microboen naar mRNA ook antisense RNA produceren, waarmee
genexpressie gereguleerd kon worden.
In deze tijd zijn er ook enkele mechanismen ontwikkeld om de DNA oligomeren te vormen.
2 problemen met oligomeren:
1. Niet gemodificerde oligomeren zijn sterk negatief geladen. Hierdoor is diffusie over het
ongeladen membraan van de cel moeilijk.
2. Cellen hebben vele enzymen die vreemd DNA klieven.
Ts’o en Miller vervingen alle zuurstof moleculen in de fosfaat groepen in dee oligomeren voor methyl
groepen. De methylphosphonates hebben geen lading. Hierdoor werdt de opname in de cel
vergemakkelijkt en nam ook de afbraak van de moleculen af. Echter zijn deze moleculen nu erg
hydrofoob, wat massa productie moeilijk maakt.
Shinozuka en Zon vervingen de zuurstof moleculen in de fosfaat groepen voor een negatief geladen
zwavel atoom (de S-oligos). Deze oligos zijn wateroplosbaar, en dus beter te produceren en
weerstaan ook enzymen. Later bleek dat zowel deze als de normale oligos toch makkelijker door de
cel opgenomen werden middels endocytose.
Studies in dieren vertonen dat de (S-)oligos bijna geen toxiciteit vertonen. In cellijnen lijken de oligos
echter welk regelmatig aan andere moleculen dan hun doelwit te binden.
De eerste oligos die op de markt komen zullen waarschijnlijk gericht zijn tegen een virusinfectie
(zoals papilloma en HIV (middels het gag gen)). Er wordt ook gekeken naar oligomers als behandeling
voor leukemie (bij ex vivo bone marrow purging op p53 en c-myb). Ook als ze werken zullen ze voor
een echte behandeling in combinatie met andere midellen gebruikt gaan worden: twee
behandelingen die via andere mechanismen werken blijken effectiever.
Voor nu zijn oligomers nog duur om te maken en moeten de delivery mechanismen verbeterd
worden. Er worden nu oligomers ontwikkeld met een andere backbone om de potency (stabiliteit
van verbinding) en de specificiteit te verhogen.
Ribozymen herkennen specifieke basen sequenties in mRNA waarna deze geknipt worden.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller FFV. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $5.89. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
67474 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now