Class notes
Licht- en Elektronenmicroscope - Hoorcolleges deeltentamen 1
- Course
- Institution
Aantekeningen voor alle hoorcolleges Licht- en Elektronenmicroscopie voor deeltentamen 1 (2019/2020)
[Show more]
Seller
Follow
FFV
Reviews received
Content preview
Licht- en Elektronenmicroscopie – Hoorcolleges deel 1Hoorcollege 1: 11 november 2019
Vrij technische cursus. De eerste week is echt fundamenteel, dit wordt steeds meer toegepast. Doel
van microscopie is niet per se mooie plaatjes te maken.
Golgi staining was een beetje een geluk bij een ongeluk omdat 50% van de cellen gestaind werden,
waardoor je deze dus goed kon onderscheiden.
Cellen gedragen zich heel anders op stijve plaatjes dan op een soepel substraat. Stamcellen worden
bijvoorbeeld bot op stijf materiaal en neuronen op zacht materiaal. We moeten dus niet alleen maar
naar celkweek op glaasjes kijken. We gaat steeds meer naar 3D microscopie heen.
Weefsels zijn niet transparant waardoor licht er niet door heen kan. Biologen werken vaak aan
transparante model organismen (c. elegans en de zebravis). Clearing technieken maken niet-
transparante weefsels transparant. Niet-transparantie komt door verstrooiing van licht (door lipiden
in bijvoorbeeld myeline schede in de hersenen). Deze lipiden kunnen weggewerkt worden.
In de zebravis is er een neuron die fluorescerend licht geeft als het neuron actief is. Zo kan van vele
neuronen de activiteit tegelijk gevolgd worden door een fluorescentie microscoop. Dit is enorm veel
data op enorm veel verschillende vlakken. Microscopie wordt steeds complexer: de files worden
enorm groot en moeilijk te analyseren.
Wat is de grootte van…
- Een cel: 20-30 micro meter (10-6 meter)
- De nucleus: 10-20 micro meter (10-6 meter)
- Een bacterie: 1 micro meter (10-6 meter)
- Een mitochondrium: 1 micro meter (10-6 meter)
- Een endosoom: 100 nanometer (10-9 meter)
- Een virus: 50 nanometer (10-9 meter)
- Een eiwit: 5-10 nanometer (10-9 meter)
- Een aminozuur: 1 nanometer (10-9 meter)
- Een atoom: 1 engstrum (10-10 meter)
Resolutie: de kleinste afstand (of spaciële frequentie, 1/lengte) tussen twee objecten waarop je de
twee objecten van elkaar kan onderscheiden. Hoe kleiner het getal, des te hoger is de resolutie. Een
hoge resolutie betekent dat je op een kleine afstand dingen kan onderscheiden.
Het scheidende vermogen van de mens is iets van 200 micrometer.
Het scheidende vermogen van de lichtmicroscoop is iets van 250 nanometer, middels super resolutie
kom je nu tot 10 nanometer.
Het scheidende vermogen van de elektronenmicroscoop is iets maximaal 1 engstrum.
Met de elektronenmicroscoop heb je een laag onderscheidend vermogen waardoor je eigenlijk niet
weet waar je naar kijkt. Daarnaast kun je met een elektronenmicroscoop niet naar levende cellen
kijken. Je moet namelijk altijd je cel in coupes bekijken. Elektronenmicroscopen kosten relatief veel
tijd en geld. Voordeel van elektronenmicroscopie is de resolutie, en je kan de context van een cel
zien. Bij scanning elektronenmicroscopie hoef je geen coupes te maken, maar is de elektronen dosis
zo hoog dat de cellen alsnog dood zijn.
Bij lichtmicroscopie kun je redelijk eenvoudig bepaalde componenten aankleuren. Je hebt hier dus
selectieve labeling en het kan op levende cellen.
Waarom licht?
1. Live-cell imaging
,2. Selective labeling
Waarom elektronen?
1. Beste resolutie
2. Context
Eigenlijk wil je eerst licht microscopie doen en dan pas elektronenmicroscopie.
Je wilt eigenlijk zo min mogelijk licht gebruiken.
Microscopie begon in Nederland
- Janssen gebruikte twee lenzen (omgekeerde teloscoop) om dingen te vergoten. Dit heette de
compound microscoop. Het risico hiervan is dat twee lenzen elkaar kunnen verstoren.
- Van Leeuwenhoek gebruikte één lens waardoor er geen verstoring was. Dit is eerder een
soort loop. Hiermee kon hij bijvoorbeeld bloedcellen zien stromen in de staart van de aal en
zag hij kleine beestjes in slootwater zwemmen. Zo was hij de vader van de microbiologie. Hij
was ook de eerste die spermacellen zag zwemmen.
Tegenwoordig heb je een tafel vol apparatuur (om camera’s goed aan te sturen, voor goede
belichting etc.). Nu kun je afzonderlijke moleculen in levende cellen zien.
Licht is een elektromagnetische golf. De kleur van het licht correspondeert met de golflengte. In
principe is kleur continu. Licht heeft tevens eigenschappen van deeltjes (dit wordt vooral belangrijk
bij fluorescentie microscopie). De golf eigenschappen worden vooral gebruikt voor resolutie en
interferentie. Licht komt altijd in discrete eenheden, dit zijn de fotonen. Fotonen hebben een
vaststaande hoeveelheid energie, dit correspondeert ook met de golflengte.
Een duidelijke golf eigenschap is interferentie een duidelijke deeltjes eigenschap is dat het altijd in
vaststaande pakketjes van energie komt.
Elektromagnetische straling is de straling die ontstaat als je een lading laat
oscilleren. Het elektromagnetische spectrum loopt veel verder dan het
zichtbare licht.
- Van radiogolven (10-100 meter) tot gammastraling (sub nanometer).
Radiogolven zijn grotere golven die een langere dracht hebben.
Kleinere golflengten hebben een veel kleinere dracht.
Maxwell kon de verschijnselen licht, elektromagnetisme en lading onder één
noemer brengen. Het oscilleren van deeltjes van een bepaalde lading zorgt
dus voor elektromagnetische straling.
- Het elektrische veld en het magnetische veld staan altijd loodrecht op elkaar.
Zichtbaar licht, wat gebruikt wordt voor licht microscopie, loopt van 400 nm (blauw) tot 700 nm
(rood). Ultraviolet is minder dan 400 nm, infrarood is meer dan 700 nm. UV licht gaat niet door glas
omdat het een lage dracht heeft. IR gaat wel door glas maar heeft een veel slechtere resolutie.
De resolutie van lichtmicroscopie is ongeveer de halve golflengte (350-200 nm).
Interferentie: golven kunnen elkaar versterken of uitdoven.
- Als golven in fase zijn, dan versterken ze elkaar. Dit betekent dat de pieken tegelijk zijn en ze
elkaar optellen.
, - Als goven uit fase zijn, dan doven ze elkaar uit. Dit betekent dat de piek van de ene golf
tegelijk is met het dal van de andere. Als de golven met een verschil in afstand van een halve
golflengte aankomen heb je licht wat uit fase is.
De lens buigt het licht op zo een manier af dat er ergens een scherp beeld ontstaat.
Eigenschappen van licht:
- Monochromatisch: licht met dezelfde golflengte, dit heeft dus één kleur.
- Polychromatisch: licht van meerdere golflengtes en dus meerdere kleuren.
- Gepolarizeerd: licht wat in één richting oscilleert (tegenover het elektrische en magnetische
veld). Vaak kijk je dan naar de oriëntatie van de oscillatie van het elektrische veld.
- Niet-gepolarizeerd: licht wat in verschillende richtingen oscilleert. Bij een normale lichtbron
heb je alle oriëntaties.
- Coherent: alle golven lopen in fase, een laser is bijvoorbeeld een coherente lichtbron.
Hierdoor kan het hele hoge intensiteit krijgen: het versterkt elkaar alleen maar.
- Niet-coherent: de golven lopen willekeurig.
- Colliminated: licht is gefocust op één punt.
- Niet-colliminated: licht waaiert uit, meestal bij een lamp. Door een lens kun je dit focussen.
Snelheid van licht: c = frequentie x
golflengte = 3 x 108 m/s
- Verandering van snelheid zorgt
voor een verandering van richting
van het licht
Energie van een photon: E = Planck’s
constante (h) x frequentie = 4 x 10-19 joule
- Dit is genoeg om een molecuul aan
te slaan
Licht kan interacteren met materie:
1. Licht kan gereflecteerd worden (reflectief)
2. Licht kan geabsorbeerd worden (ondoorzichtbaar)
3. Licht kan gediffracteerd worden (verstrooiing)
4. Licht kan getransmisseerd worden (transparant)
5. Licht kan geabsorbeerd worden en op een andere
golflengte uitgezonden worden (emissie), dit wordt
gebruikt bij luminescentie
Ons oog kan intensiteit en kleur (in het zichtbare spectrum) relatief goed waarnemen. Wij kunnen
geen faseverandering en polarisatie (van welke richting/verstrooiing komt het licht aan) waarnemen.
- Sommige dieren kunnen polarisatie wel waarnemen hiermee kunnen ze navigeren.
- Intensiteit = kwadraat van amplitude (uitslag van lichtgolf)
o Intensiteit wordt vaak logaritmisch weergegeven. Bij lage intensiteit is het
onderscheidende vermogen veel belangrijker. Dit kan zorgen voor veel
gezichtsbedrog.
- Contrast = wat je kan onderscheiden ten opzichte van een vaste achtergrond
o Bij dark field zie je alleen verstrooid licht, doordat je geen achtergrond hebt zie je
een heel sterk contrast. Als I achtergrond vrijwel nul is, wordt de breuk heel groot.
, Ons oog kan intensiteit onderscheiden volgens een logaritmische schaal.
Rhodopsine (met cofactor retinal, van vitamine a) kan licht absorberen. De co-factor is nodig om
zichtbaar licht te detecteren, de meeste aminozuren kunnen dit namelijk niet. Als een foton wordt
waargenomen verandert de co-factor van conformatie, hierdoor verandert ook rhodopsine van
conformatie. Na het absorberen van een foton laat de co-factor los en moet rhodopsine dus opnieuw
geladen worden. Rhodopsine dient alleen voor zwak licht. De absorptie van rhodopsine is maximaal
500 nm.
- Tryptofaan kan met UV licht (280 nm) worden aangeslagen. Er is geen aminozuur wat
zichtbaar licht kan detecteren.
Photopsine dient voor kleur herkenning. Ook nu is cofactor retinal nodig. Nu zijn er drie mooie
absorptie pieken. Er zijn drie varianten om zo de drie kleuren (rood, blauw en groen) te kunnen
onderscheiden.
GFP is zonder cofactor fluorescerend.
Als je licht mengt krijg je wit licht: addative color mixing. Je hebt nu rood, groen en blauw die je moet
mixen om wit te zien. Je hebt dus drie basiskleuren die je op allerlei manieren moet mengen, hoe dit
dan een kleur geeft wordt bepaald door ons oog.
Bij verf heb je substractive color mixing, wat betekent dat je kleuren juist weg moet vangen.
Hoorcollege 2: 12 november 2019
Bij geometische optica behandel je licht als stralen (dus niet zo zeer golf karakter).
- Bij een spiegel, of reflectie, is de invallende hoek hetzelfde als de uitgaande hoek (ten
opzichte van de normaal).
- Bij refractie krijg je een klein beetje reflectie, maar gaat het meeste licht ergens door. Hoe
veel licht er gespiegeld wordt of doorgelaten wordt is afhankelijk van de hoek. De
verhouding tussen transmissie en reflectie hangt af van de hoek. Onder grote invalshoeken
wordt het meeste licht gereflecteerd.
De wet van Snellius gaat over het breken van licht.
- Materiaal heeft een brekingsindex (voor lucht 1, voor glas 1.5).
- Als je naar een materiaal met een hogere brekingsindex gaat wordt de hoek t.o.v. het
normaal kleiner.
- Bij een hogere brekeingsindex breek je naar de normaal toe.
Als je naar een ander materiaal gaat, verandert de snelheid van het licht. Dit wordt veroorzaakt
doordat de golflengte verandert als je naar een ander materiaal gaat. De energie verandert in dit
geval niet (is namelijk frequentie x Planck).
Licht heeft een frequentie en een golflengte. Als je naar een ander materiaal gaat dan verandert het
aantal golven per seconde niet, maar dan verandert de snelheid van de golven wel. Bij een medium
met een grotere brekingsindex vertraagt de snelheid dus.
- De energie verandert dus ook niet (= constante van plank x frequentie).
Als de uitgaande hoek 90 graden is, is de sinus 1. Dit kan alleen gebeuren als de n1 groter is dan de
n2.
De hoeveelheid reflectie wordt steeds meer als de hoek waaronder je de oppervlakte raakt steeds
groter wordt. Bij totale interne reflectie raak je de oppervlakte onder zo een hoek dat al het licht in
het eerste medium gereflecteerd wordt.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller FFV. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $5.96. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
80796 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now