Class notes
Dictaat Ontwerp & Synthese
- Course
- Institution
- Book
In dit document worden alle colleges van Ontwerp & Synthese beschreven. De colleges zijn samengevat en bevatten duidelijke afbeeldingen.
[Show more]
Connected book
Book Title:
Author(s):
- Edition:
- ISBN:
- Edition:
More summaries for
-
Pharmacochemistry Summary + Exam Materials
-
Samenvatting Medicinal Chemistry
Seller
Follow
fleurvdende
Reviews received
Content preview
Dictaat Ontwerp & SyntheseThema I Drug targets
College 1: X-ray en (cryo)EM
Alles in de biologie is gebaseerd op eiwitstructuren (en een beetje RNA, DNA en ligand structuren).
De functie van eiwitten wordt bepaald door de structuur ervan. Als we dus willen begrijpen hoe een
eiwit werkt, moeten we de structuur analyseren. Helaas komen we niet zomaar aan deze structuren.
Hoe komen we aan eiwitstructuren?
1. Eiwit expressie (bacterie cultuur)
2. Eiwit zuivering (chromatografie)
3. Zuiver eiwit (SDS-page)
4. Zuiver eiwit oplossing.
Met deze oplossing kunnen we nog niet zoveel, we hebben nog geen structuur. Hier zijn twee
dominante methoden voor: (1) X-ray crystallography en (2) elektronmicroscopie. Beiden maken
gebruik van erg kleine golflengtes. De golflengte van zichtbaar licht is veel te groot en wordt dus niet
beïnvloed door de aanwezigheid van eiwitstructuren. Daarom worden kleinere golflengtes gebruikt.
Kristallografie (X-ray)
Kristallografie → We gebruiken kristallen omdat één eiwit te klein (te weinig massa) is om
röntgenstraling te beïnvloeden. Door kristallen te groeien zitten duizenden eiwitten netjes bij elkaar
en verstrooien ze röntgenstraling op dezelfde manier.
Stap 1: Eiwit kristallen
Je begint met een oplossing van zout, buffer en nog wat andere dingen, waar je vervolgens wat
eiwitoplossing in brengt. Dan sluit je dit kamertje af en ontstaat verdamping, waardoor het eiwit
geconcentreerder raakt en dus eigenlijk niet meer in een oplossing wil zitten. Meestal krijg je hierbij
eiwitprecipitatie, maar zo nu en dan ontstaan kristallen. Het probleem is dat dit niet vaak is. We
weten dan ook niet welke condities nodig zijn om voor kristallen te zorgen, dus we proberen maar
wat.
Benodigdheden: een zout, een buffer en een precipitant. Precipitanten binden water om zich heen,
waardoor er minder water beschikbaar is voor het eiwit. Tegenwoordig zijn er platen beschikbaar
met allerlei verschillende oplossingen, waardoor het sneller gaat om de goede conditie te vinden.
Echter is het maken van deze platen nog steeds te veel werk voor personen, dus zijn er kristallisatie
robots. Voordelen: (1) Het gaat veel sneller en kost je zelf minder werk, en (2) met robots kun je veel
kleinere hoeveelheden pipetteren.
Stap 2: X-ray diffractie
Meestal zijn deze kristallen niet goed. De reden dat we kristallen groeien, is dat we dan heel veel
eiwitten bij elkaar hebben die de röntgenstraling samen tegelijk beïnvloeden. Je moet de kristallen
dus nog bewerken, zodat ze gebruikt kunnen worden voor X-ray diffractie.
Vervolgens zijn hele sterke röntgenstralen nodig, die op speciale plekken worden gemaakt
(sinchotron). Elektronen zitten in een vacuümbuis en elke keer dat ze de bocht omgaan, verliezen ze
energie. Deze energie wordt omgezet in röntgenstralen die gebundeld kunnen worden. Hierbij
ontstaat hele sterke röntgenstraling, die wel met een heel klein puntje kan worden gericht.
,Uiteindelijk krijg je een diffractie patroon. Vanuit dit diffractie patroon kunnen we een elektronen
dichtheid berekenen, die ons verteld waar de aminozuren zitten. Dan kun je je aminozuur vouwen en
bouwen binnen de elektronen dichtheid.
Interferentie van golven (water, geluid, licht)
Alle golven zullen interactie met elkaar hebben. Als
je puntbronnen hebt, zullen na interactie plekken
met pieken en plekken met dalen ontstaan. Ze
kunnen elkaar dus versterken of elkaar
tegenwerken. Dit gebeurt ook bij eiwitten. De
elektronen zullen namelijk allemaal de
röntgenstraling op een bepaalde manier
weerkaatsten, waardoor er interactie plaatsvindt
tussen de golven. Elk atoom heeft een
elektronenwolk, dus elk atoom draagt bij aan
de diffractie. Het diffractie patroon is een
Fourier transformatie: een optelling van
golven.
Het diffractiepatroon vertelt iets over de
structuur van de bron. Een röntgenstraal
komt maar op één kant door het kristal.
Daarom draaien we het kristal, waardoor er
elke keer een net ander diffractiepatroon
ontstaat. Zo kun je een driedimensionale
diffractiepatroon samenstellen. Het kan
maanden duren tot hier een structuur uit kan
worden gemaakt.
Cryo-EM
Hier kijken we wel naar individuele eiwitten, echter zijn deze ingevroren in de oplossing. Het signaal
bevat hier vaak heel veel ruis. Daarom gaan we m.b.v. de computer alle individuele eiwitten isoleren
en middelen, waardoor het signaal wordt versterkt. Doordat alle eiwitten op verschillende manieren
zijn ingevroren, krijgen we verschillende aanzichten van hetzelfde eiwit en kunnen we daarmee de
3D-structuur bepalen.
Deze methode voor het weergeven van eiwitstructuren wordt tegenwoordig steeds meer gebruikt,
omdat kristallografie heel veel werk is en er heel veel eiwit verloren gaat. Bij elektronenmicroscopie
is dit veel minder. Daarnaast kunnen van grote eiwitten vaak geen kristallen worden gemaakt, omdat
ze erg flexibel zijn en weinig contactpunten hebben.
,Voordelen Cryo-EM:
• Elektronen hebben veel kleinere golflengten dan licht. Hierdoor kan veel meer in detail
worden gemeten. We kunnen zelfs zover kijken dat we delen van cellen kunnen
onderzoeken. Dit doen we door bepaalde eiwitten, zoals ribosomen, te isoleren uit de cel en
deze te analyseren met een elektronenmicroscoop.
• Er zijn geen kristallen nodig. Het sample kan vanuit het buisje bijna direct worden bekeken
o Werking: het sample (pure eiwit) wordt vanuit het buisje op een grid geplaatst,
waarna het overschot aan sample wordt weggehaald met een filterpapiertje. Je
houdt dan een heel dun laagje van je eiwit over, wat je invriest in ethaan. Hierdoor
wordt de oplossing als een glasvormige staat wordt ingevroren. Anders zou je
kristalvorming krijgen. Dit gaat allemaal met een machine (de vitrobot).
Over de grid ligt een laagje koolstof met gaten. We bekijken de gaten in het koolstoflaagje. Hierin
zitten namelijk de eiwitten. De eiwitten worden dus ingevroren in allerlei verschillende oriëntaties,
waardoor je een 3D structuur kunt genereren.
Dit gaat vervolgens de microscoop in. Je wilt heel veel plaatjes hebben, want hoe meer data je hebt,
hoe sterker je signaal is.
, Image formation
Röntgenstralen worden gescatterd door de elektronen in het sample.
Elektronen worden gescatterd door het hele elektromagnetische veld in een sample. Ze worden veel
sterker verstrooid dan röntgenstraling. Elektronen hebben dan ook veel meer interacties, waardoor
je met minder sample kan analyseren. Je kunt met elektronen individuele eiwitten zien.
Elastic scattering = scattering zonder verlies van energie, er vindt lichte verstrooiing plaats.
• Image formation
Inelastic scattering = scattering met energie verlies, er vindt hele erge verstrooiing plaats. Hierbij
kunnen ook dingen gebroken worden (schade). De dosis moet dus niet te hoog zijn.
• Radiation damage, dit is een heel groot probleem.
Een licht sample geeft dus een te laag signaal, maar een hoog sample geeft schade. Hierdoor
ontstaan afbeeldingen met veel ruis.
Van deze 2D afbeeldingen, moeten 3D modellen worden gemaakt. Je weet nog niet hoe het eiwit
eruit gaat zien. Je hebt allemaal verschillende aanzicht punten, maar je weet de verhouding van deze
punten niet. Er zijn verschillende methoden om een 3D model te maken.
Structuur interpretatie
Je krijgt de structuur, dus je weet waar liganden zitten, helices, etc. Als je het eiwit beter wil
begrijpen, moet je de structuur interpreteren. Hiervoor zijn structuurbiologen ook nodig. Zij
genereren dus niet alleen modellen, mar moeten ze ook interpreteren.
Samenvattend
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller fleurvdende. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.34. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
62555 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now