Summary
Samenvatting scheiding en zuivering van biomoleculen
- Course
- Institution
Volledige samenvatting scheiding en zuivering van biomoleculen
[Show more]
Seller
Follow
angelika0804
Reviews received
Content preview
Samenvatting Scheiding & zuivering van biomoleculen1 Inleiding
Biochemie = studie van chemische processen in levende organismen met als doel het begrijpen van
het moleculaire werkingsmechanisme van de cel
Oplossing = homogeen mengsel van 1 of meerdere substanties in een vloeibare component
Moleculaire massa (MW) = aantal dalton
Verdunningen: M1 V1 = M2 V2
Elektrolyten:
Ionisatie = uiteenvallen van ionen
Sterke electrolyten: irreversiebele ionisatie omdat ze door ionaire bindingen worden
samengehouden, niet covalente
Zwakke electrolyten: reversibele ionisatie
o Bv carboxylgroep: O-H is covalent gebonden maar partieel positief + bij afsplitsing
krijg je vrije electronen
Non-electrolyten: geen ionisatie
Indien zowel sterke als zwakke electrolyten worden gebruikt: hoeveelheid individuele ionen meten:
1 1
( c 1 z 1 +c 2 z 2 +…+ cn z n )=μ= ∑ c z
2 2 2 2
μ=
2 2
o C = concentratie in molariteit
o Z = lading van individueel ion
o μ of I = ionische sterkte (in M)
o Meervoudige ionen doen de ionische sterkte snel stijgen
Activiteiten en activiteitscoëfficiënten van ioniseerbare componenten
Ionen zijn geladen en gaan interacties aan met elkaar beïnvloedt het gedrag van aparte
ionen daarom beter ionen activiteiten gebruiken
Ionische sterkte beïnvloedt de effectieve concentratie van ioniseerbare stof waarbij
effectieve concentratie (activiteit = A) in verband staat met nominale concentratie door
afctor = activiteitscoëfficiënt γ
Ax = [X] γx
o Ax = activiteit stof X, (X) = nominale concentratie en γ x de activiteitscoëfficiënt van X
o γ is een maat voor afwijking ionisatiegedrag van de stof
2 Celcultivatie
2.1 Inleiding
Celcultivatie = cellen laten groeien onder gecontroleerde omstandigheden.
Artificieel medium; bestaande uit: nutriënten, geschikt groeioppervlak en ideale condities van
temperatuur, vochtigheid en atmosfeer.
Waarom celcultuur?
Ethisch beperkt aantal dierproeven
Omzeilt complexiteit dier-/orgaan experimenten
Specifieke toepassingen:
Screenen/testen nieuwe therapeutische compounds
Relatief eenvoudige, efficiënte en snelle productie van therapeutisch relevante biologische
compounds zoals hormonen, eiwitten, antilichamen
o Recombinant DNA techniek recombinatie eiwitten
1
,Samenvatting Scheiding & zuivering van biomoleculen
o Complexe geneesmiddelen die niet via chemische synthese kunnen worden
geproduceerd
Ontwikkeling vaccins
Fundamenteel onderzoek
In vitro fertilisatie
Soorten celcultuur:
Primaire celculturen
o Na eerste subcultuur is de primaire celcultuur een cellijn
o Eindige cellen omdat ze hun senescentie (proliferatiecapaciteit) verliezen.
o Voordelen:
Reflecteren beter de in vivo situatie
Behouden normale inverse relatie tussen celgroei en differentiatie
o Nadelen:
Beperkte levensduur
Cel-specifieke functies verminderen in functie van tijd
Kan worden verbeterd door het toevoegen van additieven
Beperkte reproduceerbaarheid
Beperkte beschikbaarheid
Ethisch dossier noodzakelijk bij gebruik humaan materiaal
o Voorbeelden:
Fibroblasten
Lymfocyten
Endotheelcellen
Niercellen
Vasculaire gladde spieren
osteoblasten
Continue cellijnen
o Afgeleid van tumoren
o Geïmmortaliseerd: via transformatie primaire cellen door introductie oncogenen
o + Hoge reproduceerbaarheid
o - Verlies functionele karakteristieken van normale cel
o Voorbeelden:
HELA cellen
Chinese Hamster Ovary cells
HepG2 humane levertumor
UMR-106 rat osteosarcoma cellijn
2.2 Basisapparatuur
Recipiënten:
T flask: 25 cm2 – 175 cm2
Spinner flask: voor cellen die kunnen groeien in suspensie
Roller bottle: 1050 cm2
Celcultuurplaten
Orgaan explant culturen
Poreuze membranen
Artificiële huid
Microdragers
Laminaire flow
Steriele condities
Steriele lucht na passage HEPA filter (high efficiency particulate absorbing)
Incubator
2
,Samenvatting Scheiding & zuivering van biomoleculen
Groeien en onderhouden celculturen
2.3 Groeikinetiek van cellen
Parameter voor groei: gemiddelde verdubbelingstijd = inverse groeisnelheid
2.4 Groeivoorwaarden
Groeimedium
Medium voor cultuur boost in vivo omgeving
Meestal serumhoudend
Afhankelijk van de cultuur
Klassieke media worden gebufferd met natriumcarbonaat
pH controle door regeling pCO2 / fosfaatbuffer
fenolrood pH indicator
2.5 Toepassingen
Adherente cellen blijven groeien tot confluentie
opstarten subculturen
cellen suspenderen (losmaken: mechanisch/trypsine of andere proteasen)
2.6 Invriezen van cellen
Cryopreservatie
-196°C vloeibare stikstof
Cellen in log-fase
Toevoegen cryoprotectant
Voordelen:
Vermindert risico op microbiële contaminatie
Voorkomt dat alle cellen op elk ogenblik in celcultuur dienen gebracht te worden gehouden
Mogelijkheid tot experimenten met cellen met consistent aantal passages
Vermindert risico op genetische drift (evolutionair proces waarbij er een verandering
optreedt in de frequentie van een genvariant) en morfologische veranderingen
2.7 Celtelling
Hemocytometer
# leefbare cellen/ml = # ongekleurde cellen in n vierkanten/n * verdunning * 10 4
Trypaanblauw
Goede celcultuur indien > 90%
Celproliferatietest
Doel: bepaling celviabiliteit maat voor celproliferatie
Kwalitatieve colorimetrische test
Principe:
o Kleurreactie door omzetting van tetrazoliumzout (MTT 3-(4,5-dimehtylthiazol-2- yl)-
2,5-diphenyltetrazolium, toegevoegd aan celcultuur) in formazan door
mitochondriale enzymes (succinaatdehydrogenase)
o Formazan wordt opgelost in isopropanol of DMSO
→ Intensiteit kleurreactie is evenredig met metabolische activiteit levende cellen
Coulter counter
Bepaling aantal en grootte partikels en cellen
Principe:
o Gebaseerd op de detectie van veranderingen in elektrische geleidbaarheid (of
weerstand) wanneer een celbevattende elektrolietenoplossing doorheen een kleine
opening wordt gestuurd.
o Aangezien cellen niet-geleidend zijn zal aldus de effectieve doorsnede van het
geleidingskanaal veranderen wat gemeten wordt als een spanningsverandering
tussen 2 elektroden
3
, Samenvatting Scheiding & zuivering van biomoleculen
3 Celfractionatie
= scheiding en zuivering van cellen
3.1 Zuiveren van cellen
3.1.1 Centrifugatie op gradiënt
Principe gebaseerd op verschillende dichtheden scheiden
Dichtheidsgradiënten kunnen worden bekomen door verschillende lagen gradiëntmedia in
een proefbuis op elkaar te plaatsen in een centrifugeerbuis met de zwaarste laag onder- en
de lichtste laag bovenaan.
Eens evenwicht is bereikt heegt de duur van de centrifugatie geen belang meer
Bv: lymfocyten
3.1.2 Immunomagnetische scheiding
Maakt gebruik van paramagnetische korrels (1- 4.5µm)
De oppervlaktelaag van de korrels bevat hydroxyl- en epoxidegroepen voor het covalent
binden van antilichamen
Directe methode:
o Primair antilichaam gebonden op magneetkorrel bindt met specifiek antigen op de
cel
Indirecte methode:
o Antilichamen gericht tegen celspecifieke antigenen worden vooraf op de cellen
gebonden
o Daarna worden magneetkorrels waarop vooraf secundaire antilichamen gericht
tegen de antilichamen op de cellen aan de cellen toegevoegd
Cellen gebonden aan de magneetkorrels door een antigen-antilichaamreactie worden
gecollecteerd door een magneet aan de zijkant van het celbevattend recipiënt te plaatsen
Zowel voor de gerichte isolatie van een bepaald celtype als voor het verwijderen van
ongewenste cellen uit een mengsel
3.1.3 Celsortering – Flowcytometrie
Flow cytometrie is een techniek die een multi-parametrische analyse van cellen of deeltjes toelaat
terwijl ze in een vloeistofstroom cel per cel doorheen een laserstraal passeren
Hierbij kunnen de kenmerken van individuele cellen worden gemeten via hun interactie met
(laser)licht
Dit laat ook toe om cellen of deeltjes van elkaar te scheiden (flow sorting)/zuiveren op basis
van karakteristieke eigenschappen
Een flow cytometer is opgebouwd uit verschillende componenten:
Fluïdum
o Starten met single cell suspension
o Vooraf kan aan de cellen een cel-specifiek fluorochroom-geconjugeerd antilichaam
toegevoegd:
o Het fluïdum systeem van de flow cytometer transformeert het staal een
celsuspensie, in een georganiseerde vloeistofstroom waarin de cellen als het ware
worden ‘opgelijnd’ en er een duidelijke scheiding tussen de cellen is zodat ze één
voor één het analyse- of detectiepunt passeren.
Deze ‘oplijning’ gebeurt via het principe van de hydrodynamische focussering
Wanneer deeltjesbevattende vloeistof door een cilinder wordt gestuurd zal
er bij de deeltjes een snelheidsgradiënt ontstaan tengevolge wrijving ter
hoogte van de cilinderwand (viscous drag) waardoor de deeltjes naar het
centrum van de vloeistofstroom worden ‘gesleept’ (dragging)
o Flow chamber: 2 vloeistofbevattende cilinders
Binnenste bevat het staal
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller angelika0804. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $11.18. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
77254 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now