Samenvatting Uitgewerkte vragen Histologie: Methoden, Cel, Epitheelweefsel, Steunweefsel, Kraakbeen/bot en Contractiel weefsel + tekening (F. De Smet) BMW
Uitgewerkte vragen waarvan men er een aantal krijgt op het examen Histologie 1ste bac Biomedische Wetenschappen 2de semester. Telkens een grondige beschrijving van het gevraagde + een duidelijke tekening. Op pdf-bestand lijken de tekeningen wat moeilijk te lezen maar als je inzoomt/afprint zijn ze ...
Examenvragen Histologie 2021-2022 (1)
Methoden en technieken
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie
(TEM). Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken
weefsel voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
Conventionele lichtmicroscopie en TEM zijn iets of wat vergelijkbaar in hun werking. Men stuurt er
een bundel van elektronen of licht op dat zal resulteren in een 2D-beeldvorm. Er wordt weliswaar in
de cel of organisme gekeken, niet rekening houdend met de structuur van de oppervlakte van de
membraan.
Bij conventionele lichtmicroscopie wordt er zichtbaar licht gebruikt als bron, en soms ook lasers om
de foutmarge van het beeld te verkleinen. De techniek met lasers noemen we confocale
lichtmicroscopie. Het duurt langer dan wide-field lichtmicroscopie, maar geeft een meer
gedetailleerd beeld. Met een lichtmicroscoop kan men al een heel wat dingen onderzoeken zoals
levende cellen via Brightfield en fase-contrast microscopie (geeft de mogelijkheid om mitose/meiose
waar te nemen bv). Daarnaast kan men ook aan de hand van fluorescente microscoop bepaalde
moleculen detecteren door hun gelabelde/fluorescente antistoffen. Staalbereiding is niet zo moeilijk
bij conventionele lichtmicroscopie. Afhankelijk van wat men wilt onderzoeken kan men het preparaat
levend, gefixeerd (met formaldehyde of glutaaraldehyde) of ingevroren bekijken. De resolutie dat
men kan behalen met lichtmicroscopie licht rond de 200 nm wat maakt dat virussen en kleinere
partikels niet zichtbaar zijn met een lichtmicroscoop.
Voor partikels kleiner dan de resolutie van lichtmicroscopen kan men een elektronenmicroscoop
gebruiken (resolutie= 0,1 nm). Hieronder vallen virussen, DNA, individuele moleculen/ atomen etc. In
plaats van zichtbaar licht beschiet men het preparaat met elektronen via een vacuüm
elektronenbuis. Als de buis niet vacuüm zou zijn, zouden de elektronen interageren met de vrije
zuurstofmoleculen wat leidt tot een vervuiling van het beeld. Het TEM werkt als volgt: een dikke laag
laat niet veel elektronen door en resulteert in een donker beeld. Anderzijds laten dunne lagen heel
veel elektronen door en geeft dus een licht beeld. Dit wordt uiteindelijk weergegeven op een scherm
en is niet zoals lichtmicroscopie waarneembaar met een oculair. Om het contrast tussen dikke en
dunne lagen beter weer te geven kan men aan Os-kleuring doen. Een techniek waarbij men Os
moleculen toevoegt aan het preparaat waardoor Os makkelijk bindt aan de membranen en dus
dikkere lagen creëert. Preparaten dienen gefixeerd te zijn met glutaaraldehyde om vetten te bewaren
(sterkere fixatie dan formaldehyde wegens 4 c atomen in plaats van 1) en kleiner gesneden te zijn
(20nm). Een nadeel van elektronenmicroscopen is dat men enkel een zwart-wit beeld kan genereren.
2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze
gebruikt?
1
,Het doel is om weefsel zo te bewaren dat de oorspronkelijke toestand, zowel chemisch als
structureel, zoveel mogelijk bewaard blijft. Hiervoor dienen afbraakprocessen, zowel door intrinsieke
als externe factoren, zoveel mogelijk afgeremd en voorkomen te worden en moet de
macromoleculaire structuur zo intact mogelijk gehouden te worden.
Fixatie proces:
Om weefsel te fixeren wordt het ondergedompeld in een fixatievloeistof (fixator) waardoor er
covalente bindingen gevormd worden met de N-terminale groepen van eiwitten, volgens een process
dat “crosslinking” wordt genoemd, de eiwitten worden op die manier aan het cytoskelet en hun
interagerende eiwitten vastgehecht waardoor de structuur zoveel mogelijk bewaard blijft. Door het
fixatieproces verliezen de meeste enzymen ook hun enzymatische werking. De duur van fixatie
varieert van 2h tot 24h, afhankelijk van de grootte van het te fixeren materiaal, en de gebruikte
methode van fixatie en fixator. De hoeveelheid fixator dient minimaal 5x het volume te zijn van het
weefsel. De meest gebruikte fixator is formol, een waterige oplossing op basis van formaldehyde.
Ook kan het weefsel bewaard worden door het in te vriezen. Dit dient zeer snel te gebeuren en is
enkel geschikt voor kleine weefselstukken. Om het weefsel in te vriezen wordt het zeer snel
ingevroren in een OCT oplossing (een visceuze oplossing van glycol en bepaalde soorten hars) aan de
hand van onderkoeld isopentaan waarna het kan gesneden worden in zogenaamde vriescoupes met
een gekoeld microtoom. Het bevroren weefsel kan dan verder gestockeerd worden in speciale
diepvrieskasten Bij invriezen blijft de structuur van de eiwitten ongewijzigd en enzymatische
processen worden sterk vertraagd tot stilgelegd. Als vriescoupes terug op een temperatuur van 37°C
gebracht worden, verkrijgen de aanwezige enzymen terug hun volledige functie.
Fixatie bij lichtmicroscopie:
- Meest gebruikt = formol (waterige opl op basis van formaldehyde)
- Nadeel: ook DNA en RNA kan gecrosslinked worden- (omkeerbaar, maar nucleïnezuren dan
vaak gefragmenteerd, niet te klein + niet te lang en optimaal bewaard ⇒ genetische analyse
nog mogelijk)
Fixatie bij EM:
- Ultrastructureel niveau
- Kleinste weefselverval = zichtbaar ⇒ weefsel minder beoordeelbaar (na enkele min al
osmotische zwelling v- mitochondria en ER)
- Fragmenten max 1-2 mm groot
- Fixatie in gekoelde glutaaraldehyde (4°C) gevolgd door 2e fixatie in osmiumtetroxide (OsO4)
om vetten te bewaren (laatste reactie ⇒ extra zichtbaar maken)
- Glutaaraldehyde = sterker fixatief dan formaldehyde (ook eiwitten die verder van elkaar
zitten aaneen hangen ⇒ steviger netwerk)
Verder verwerken:
Gefixeerd weefsel = nog zacht ⇒ inbedden in paraffine om te kunnen snijden
MAAR: fixatieven zijn watergebaseerd ⇒ niet zomaar mengbaar met paraffine (hydrofoob)
2
,Oplossing: ontdoen van water door weefsel in oplopende concentratiegradiënt te plaatsen van
alcoholoplossingen (op hun beurt uitgespoeld met tolueen of xyleen) ⇒ opgesteven ⇒ blok ⇒
snijden van coupes op een microtoom
- Dikte voor lichtmicroscopie: 5µm
- Dikte voor EM: 20nm
- Let op: HARS ipv paraffine voor EM (dunnere schijfjes mogelijk)
- Kleuring
3. Geef de gelijkenissen en verschillen tussen immunohistochemie en
immunofluorescentie.
Beide technieken hebben als doel om kwalitatief te bepalen of een bepaalde eiwit aanwezig is in het
preparaat of niet. Beide technieken maken gebruik van specifieke antistoffen die zullen binden op
het te willen onderzoeken eiwit, dit zijn afweerproducten aangemaakt door het immunologisch
afweersysteem vd gastheer. Eén specifiek antigeen kan meerdere bindingsplaatsen (epitopen)
bevatten voor antilichamen, we onderscheiden polyklonale monoklonale antilichamen:
- Polyklonaal ⇒ meerdere antilichamen tegen 1 antigeen, binden elks met een ander epitoop;
mogelijkheid tot kruisreacties met gelijkaardige epitopen op een totaal ander antigeen
- Monoklonaal ⇒ 1 antilichaam bindt op 1 soort epitoop; specifieker
Wanneer een bepaald eiwit met antigeen in de weefselcoupe aanwezig is, zal hiertegen een gerichte
antistof kunnen worden toegevoegd en een
immuuncomplex vormen. Het grote verschil zit in hoe
de antistoffen het visueel zichtbaar zullen maken.Beide
technieken kunnen worden gebruikt in de diagnostiek
van een ziekte bijvoorbeeld, maar worden ook voor
heel wat andere toepassingen ook gebruikt.
Immunohistochemie:
Bij immunohistochemie gebruikt men een secundair antistof, met daarop een HRP-polymeer
(peroxidase) of een alkalisch fosfatase, dat zal binden op plaatsen met een primair antistof
waardoor via een chemische reactie een bruine kleur ontstaat.
3
, Immunofluorescentie
Bij immunofluorescentie, wordt er gewerkt met een fluorescent signaal. Een gelabeld met
fluorescente eigenschappen secundair antistof zal binden op het primaire antistof en zal oplichten als
de stof aanwezig is. Men kan ook het antistof zodanig manipuleren zodat het secundaire de
fluorescente eigenschappen draagt wat zal leiden tot signaalversterking.
4. Bespreek directe, indirecte en geampificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden? (ook
vraag 3 hierbij zetten)
- Direct: primair antistof bindt aan substraat en geeft een kleuring of fluorescent signaal mee
⇒ simpel, snel maar weinig signaalversterking en in lage hoeveelheden antigeen moeilijke
detectie; gebruik bij completentdeposities opsporing in huid- en nierbiopten waar te
onderzoeken eiwit gevisualiseerd kan worden
- Indirect: secundair antistof bindt met variabel deel aan constant deel van de antistof en leidt
dan tot een kleuring of fluorescent signaal ⇒ gevoeliger want meerdere bindingsplaatsen op
primair antistof voor secundair = meer signaal, specifieker, flexibeler maar duur; gebruik bij
visualiseren van virussen bv. spike-virus waarbij men gaat werken door een antistof te gaan
binden op het al aanwezige
- Amplificatie: secundair antistof bindt met variabel deel aan variabel deel van primair antistof.
Via streptavidin kunnen heel veel fluorescente proteïnen binden wat uiteindelijk leidt tot
signaalversterking. Men gaat van 2 antistoffen naar een heel groot aantal fluorescente/
chemische componenten. ⇒ gebruikt wanneer het signaal zelf niet zo sterk is en moeilijk
waarneembaar is met het blote oog.
5. Welke verwerkingsstappen doorloopt een weefselstukje tussen resectie tijdens operatie
en diagnostiek middels lichtmicroscopie? Licht iedere stap kort toe.
1) Operatief wegnemen van weefsel => bevindt zich in levende toestand
2) Invriezen (zie vraag 2) met vloeibare stikstof bij -80°C (zeer snel en dus meest voor de hand
liggend tijdens operatie), hoe sneller ingevroren hoe hoger de kwaliteit => nadien in coupes snijden
met microtoom (dikte coupes naargelang soort microscoop) OF fixeren (zie vraag 2) met behulp van
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller EmilieBMW. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $5.47. You're not tied to anything after your purchase.
