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Practicas de biologia molecular
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En el archivo se encontrarán distintas prácticas realizadas a lo largo del curso de laboratorio clinico y biomedico
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1PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
2007-2008
Gregorio Hueros Soto
Elisa Gómez
Yolanda Sanz
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El objetivo fundamental de esta práctica es el desarrollo de un proceso
experimental que permite la identificación de secuencias concretas de DNA, tanto
genes como secuencias no codificadoras, en el genoma de cualquier organismo. El
procedimiento empleado se basa en la utilización de la hibridación de ácidos nucléicos
y la detección de esta hibridación utilizando procedimientos no radiactivos. Los
resultados obtenidos en esta práctica proporcionarán información sobre la
organización en el genoma de las secuencias identificadas, atendiendo al criterio de
su grado de repetición, secuencias únicas o repetidas, y en este segundo caso, si
dichas secuencias se encuentran dispuestas en el genoma en tandem o dispersas.
Este procedimiento experimental (parte A de la práctica) es ampliamente
utilizado en todos los campos de la Biología molecular y tiene aplicaciones concretas
en Genética. Por ejemplo, la identificación de polimorfismos en el DNA, la
construcción de mapas genéticos, la identificación de individuos por huella de DNA o
en estudios de evolución molecular.
Adicionalmente (parte B de la práctica), ensayaremos un procedimiento de
detección de secuencias en el genoma mediante PCR. La inclusión de esta práctica
permitirá revisar, críticamente, la utilidad real de ambos métodos en el análisis
genómico.
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Parte A. INTRODUCCIÓN GENERAL
1. Hibridación de ácidos nucléicos
La posibilidad de desnaturalizar y renaturalizar el DNA permite la
hibridación de los ácidos nucléicos. Esto se consigue al desnaturalizar dos moléculas
diferentes y ponerlas luego en condiciones de renaturalización, con el objeto de que si
existen secuencias complementarias en ambas poblaciones de moléculas, éstas
puedan encontrase y formar enlaces de hidrógeno originando segmentos duplexos.
También pueden hacerse hibridaciones entre DNA y RNA, desnaturalizando el DNA y
poniendo las hebras simples en contacto con el RNA; si existen secuencias
complementarias se formarán heteroduplex DNA-RNA. Como es obvio, cuanto más
parecidas sean las dos moléculas que se pongan a hibridar, mayores será la longitud
del heteroduplex y su estabilidad.
En el experimento que se va a desarrollar, se trata de identificar por hibridación
aquella secuencia o grupo de secuencias que sean complementarias a una concreta.
2. Elementos que participan en la hibridación
Para realizar el experimento, se parte de dos fuentes distintas de DNA. En
primer lugar, el DNA blanco, en este caso el genoma de una determinada especie,
que es donde se pretende identificar una secuencia o grupo de secuencias. En
segundo lugar el denominado DNA sonda, en este caso un fragmento de DNA
previamente aislado de un genoma y que nos define un gen o una secuencia
nucleotídica concreta. Este DNA sonda está ligado a un vector, un plásmido que tiene
propiedades autorreplicativas en el interior de células bacterianas.
El aislamiento, purificación y cuantificación del DNA blanco y del DNA sonda,
constituyen la primera parte del experimento.
3. Fraccionamiento del DNA
El aislamiento de DNA de células eucarióticas da lugar a una solución de
moléculas de DNA de alto peso molecular. Si el procedimiento de extracción no
hubiera introducido roturas ocasionales, una molécula se correspondería con el DNA
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contenido en un cromosoma del complemento cromosómico de la especie. Distintas
moléculas se corresponderían con distintos cromosomas, y conjuntos de ellas con un
genoma completo del organismo. Como se parte de un fragmento de tejido constituido
por miles de células, el resultado final de la extracción es un conjunto de moléculas,
denominado DNA genómico, en el que está representado el genoma de la especie en
innumerables copias.
Para facilitar el análisis de secuencias concretas del DNA genómico, se
procede a la digestión del mismo utilizando enzimas de restricción. Estas enzimas son
endonucleasas que tienen la propiedad de reconocer secuencias cortas, de unos
cuatro a seis pares de bases en el DNA de doble hebra, y cortar el DNA en todos los
puntos donde se encuentre tal secuencia, llamada diana de restricción. Cada enzima
de restricción tiene una diana particular.
La digestión de una muestra de DNA genómico con una enzima de restricción
origina una colección de fragmentos de DNA de distintos tamaños. Los distintos
fragmentos de esta colección pueden ser separados en función de su tamaño
mediante una técnica denominada electroforesis en gel. Los geles son soportes que
constan de una matriz de moléculas largas y delgadas resultado de la polimerización
de agarosa o poliacrilamida. La matriz presenta poros cuyo tamaño puede controlarse
variando la concentración del gel. Al depositar en el gel el producto de la digestión de
un DNA genómico, colocar el gel en un tampón adecuado y aplicar una corriente
eléctrica, los fragmentos de DNA, cargados negativamente, se mueven a través del
gel hacia el ánodo. Las moléculas de mayor longitud tienen mas dificultades de
movimiento a través de los poros del gel por lo que se mueven más lentamente. Por el
contrario, las moléculas más cortas tienen menos impedimentos y se mueven más
rápidamente. Como resultado, se originará una separación por tamaños de la mezcla
de fragmentos iniciales.
Los fragmentos originados pueden ser visualizados si el gel se tiñe con
bromuro de etidio, un colorante que se intercala entre las bases del DNA y emite una
fluorescencia cuando se estimula con radiación ultavioleta. En cada electroforesis se
debe cargar en un carril una mezcla de fragmentos de tamaño conocido,
denominados marcadores de peso molecular, que permitirá estimar el tamaño de los
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