Samenvatting Hoofdstuk 2: Analyse van DNA en genomics. Studenten cursus
46 views 1 purchase
Course
Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 3 (E0F95A)
Institution
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Hoofdstuk 2: Analyse van DNA en genomics
Ideaal voor studenten die nood hebben aan meer dan enkel slides als lesmateriaal. ALLE informatie staat hierin: tekst vanop de slides PLUS mondelinge uitleg!
Dit document bevat de informatie die staat vermeld op de slides PLUS zo goed als alle informatie...
Toepassingen: De novo genoom sequentiebepaling, resequencing, sequentiebepaling als teller
1.1. Sanger sequencing = 1ste generatie sequentiebepaling
1.1.1. Maxam en gilbert: ter illustratie
Chemische klieving methode
1.1.2. Sanger sequencing = dideoxy-keten terminatiemethode
Polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs (elke ddNTP met verschillend fluorescent label)
huidige methode: fluorescent gelabelde ddNTPs & scheiding door capillaire gelektroforese
1 streng per keer wordt afgelezen beperkt tot +/- 500 nt, moeite met herhalingen
Juiste verhouding dNTPs en ddNTPs nodig
Voor betrouwbaarheid: best 2 aparte reacties (FW of RV primer) om beide richtingen af te lezen
resultaat = elektroferogram
Elektroferogram aflezen na insertie/deletie: sequentie wordt gemengd (want bulk sequencing) geen
onderscheid mogelijk (nadeel van bulk: mutatiedetectie) <-> kwaliteitsscore = hoe zeker je bent dat er wel
een nucleotide is ingebouwd (per positie: letter & score)
Kwaliteitsscores Phred score Q = -10log10(P) met P = probabiliteit van foutieve base call bv Q = 30 = kans
van 1 op 1000 dat de call foutief is = 99,9% zekerheid
(Phred score = negatieve log vd kans dat de base call foutief is)
HGP nieuwe uitdagingen: volledige seq (telomeer tot telomeer), meerdere species sequencen, meer
individuele humane sequenties, persoonlijke genoomsequentie van iedereen.
HGP veel opties voor “precision medicine”: diagnose, prognose, preventie (kennis van DNA volgorde en
SNPs); farmacogenomics; therapie op maat, ethische aspecten
1
, 1.2. Short-read next-generation sequencing = 2de generatie sequentiebepaling
Doel: veel hogere throughput aan veel lagere kost massale DNA sequentiebepaling
Voordelen: heel snel, goedkoper vergeleken met vroeger, 85-99,9% accuraatheid (Phred = 30), weinig DNA
template als input nodig
Nadelen: beperkte read lengte van 35-700 bp (niet geschikt voor de novo sequencing), door throughput
grote absolute hoeveelheid fouten zorgvuldige inspectie
3 soorten sequencing: WGS, WES (1,5% van het genoom) en targeted sequencing
Ontwikkeling van nieuwe technologieën van 2nd generation is gebaseerd op:
parallelle detectie (massive parallel sequencing)
miniaturisatie van reacties
integratie van het proces (directe detectie) (<-> scheiding via gelelektroforese)
4 stappen: aanmaak DNA library klonale in vitro amplificatie sequentiebepaling data analyse
Stap 1: aanmaak NGS DNA library
- Soorten DNA library: WGS, WES of targeted sequencing (aanrijking door hybridisatie aan probes),
amplicon sequencing (PCR amplicons) library: min. bias en voldoende complexiteit
- 1.0 voorbereiding kwaliteitscontrole van het input DNA en evt poolen van libraries (multiplexen)
o Hoeveelheid en concentratie bv spectrofotometrie, fluorometrie, elektroforese, …
o Zuiverheid bv spectrofotometrie A260/280 en A260/230 ratio
o Integriteit bv capillaire elektroforese met bio-analyzer kijken of het DNA intact is
- 1.1 Fragmentatie en evt target aanrijking (enrichment bv exonen eruit halen bij WES)
verschillende methoden vragen verschillende fragmentlengte (inserts)
o Fysisch: nebulizatie, sonicatie, acoustic shearing (ultrasone geluidsgolven, zijn heel gericht)
o Enzymatisch: DNAse1, fragmentase
- 1.2 End repair en ligatie adapters (aanhechten)
o Blunt ends maken (T4 DNA polymerase en Klenow fragment 5’3’ polymerase en 3’5’
exonuclease)
o 5’ uiteinde fosforyleren (T4 polynucleotide kinase)
o Evt 3’ non-template A (Taq polymerase)
o Ligatie met fragment uiteinden (mbv sticky end met 3’A overhang of mbv blunt end)
o Enkele PCR cycli: fragment met adapters amplificeren
o Adapters= sequencing primers + evt barcodes (per staal/molecule)
tagmentatie (in een Illumina kit) = fragmentatie en adapters aanhechten in 1 stap:
transposase enzym met dubbele activiteit (knipt en voegt adapters toe)
- 1.3 Size selection (voor of na adapter ligatie) 2 opties:
o Klassiek: Via agarose gel-elektroforese (gewenste lengtes uitsnijden en opzuiveren met
alcoholprecipitatie of ionenuitwisselingskolom
o Via magnetische beads, bindt DNA (van bepaalde lengte), verhouding DNA/beads bepaald
gebonden lengte
Stap 2: klonale in vitro amplificatie 3 ≠ methoden om scheiding tss clusters te behouden:
- in vitro: solid-phase bridge amplificatie: aanhechting aan oligonucleotiden op vast opp +
amplificatie (clusters = polonies: 1000’en kopieën van zelfde DNA molecule op een 1-2 µm spot)
- emulsie: aanhechting aan oligonucleotiden op beads + amplificatie in emulsie
(clusters: 1000’en kopieën van zelfde DNA molecule gebonden op een bead)
- rolling-circle amplificatie in oplossing: circulaire DNA template geamplificeerd (clusters = nanoballs
= concatemeren: lange DNA molecule met meerdere kopieën van template na elkaar)
2
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller leenhaegemans. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $5.53. You're not tied to anything after your purchase.
