Class notes
Pathologie Cel- en oncopathologie Aantekeningen
- Course
- Institution
Uitgebreide aantekeningen van alle hoorcolleges en practica omtrent het thema 'Cel- en oncopathologie'.
[Show more]
Seller
Follow
fleurheling
Reviews received
Content preview
PATHOLOGIEHOOFDTHEMA: CELPATHOLOGIE
HC: INTRODUCTIE CURSUS PATHOLOGIE
Pathologie = ziekteleer
-> Bestudeert het ontstaan en verloop van ziektes
HC: ONDERZOEKSMETHODEN I
Oefenvraag
Recent is er een wetenschappelijk artikel gepubliceerd in het gerenommeerde wetenschappelijke
tijdschrift OncoImmunology. De onderzoekers laten hierin zien dat de tumorcellen van
medulloblasten bij kinderen geen PD-L1 tot expressie brengen, terwijl PD1 wel tot expressie komt op
de infiltrerende CTL’s. Dit betekent dat medulloblastomen blijkbaar niet in staat zijn om cytotoxische
T cellen (CTL’s) te remmen en dat een immunotherapie gebaseerd op het blokkeren van de interactie
tussen PD-L1 (op tumor cel) en PD1 (op CTL’s) waarschijnlijk niet succesvol zal zijn.
De conclusie van dit artikel is volledig gebaseerd op immunohistochemische analyse van PD-L1
eiwitexpressie op primair tumorweefsel. U wilt graag verder onderzoek doen aan dit thema en u
heeft o.a. de tumorweefsels (van 30 patiënten) tot uw beschikking alsmede een representatieve
medulloblastoma cellijn.
1. Benoem 2 voordelen (2 pnt) en 2 nadelen (2 pnt) van het gebruik van immunohistochemie (IHC)
voor detectie van PD-L1 eiwit in medulloblastomen
PDL1 is een factor die zorgt voor celdood bij de checkpointen van de celcyclus als er iets fout gaat.
Remming hiervan zorgt er dus voor dat tumorcellen kunnen doorgroeien. Bij immunohistochemie
kleur je bepaalde eiwitten aan in weefsels m.b.v. antistoffen tegen die eiwitten.
• Voordelen: lokaliseren is mogelijk (ziet niet alleen de aanwezigheid, maar ook in welke cellen
precies), hoge specificiteit en sensitiviteit, je kan veel weefsels tegelijk screenen, snel, goedkoop,
binnen 1 kleuring kun je wel bekijken in welke cellen het eiwit meer tot expressie komt dan in
andere cellen
• Nadelen: semi kwantitatieve techniek (Je kunt niet kijken naar de eiwit expressie. Je kunt binnen
1 meting wel wat zeggen over de relatieve hoeveelheden in een weefsel, maar je kunt niet totale
hoeveelheden tussen verschillende weefsels achterhalen. Binnen 1 kleuring kun je wel bekijken
in welke cellen het eiwit meer tot expressie is dan in andere cellen.), niet alle antigenen zijn
specifiek voor één type cel, kruisreacties tussen niet-verwante antigenen kunnen ontstaan,
aspecifiek absorptie van antigenen kan optreden, antigenen uit een normale cel kunnen
diffunderen en door een naburige neoplastische cel worden opgenomen.
2. Benoem kort een experimentele aanpak waarmee op een alternatieve manier (anders dan IHC)
naar de aanwezigheid van tumor-geassocieerd PD-L1 eiwit kan worden gekeken (2 pnt)
• Met Q-PCR kun je kwantificeren hoeveel eiwit er in een stukje weefsel zit. Hiermee kun je de
hoeveelheid mRNA expressie meten. Ook dit is relatief ten op zichtte van het huishoudgen. In dit
geval moet je wel een stukje weefsel nemen waarvan je zeker weet dat het kankercellen bevat.
• ELISA is een kwantitatieve techniek ook. Je neemt altijd een ijklijn mee waardoor je je eiwit kunt
vergelijken met de ijklijn. Hierdoor kun je precies achterhalen hoeveel eiwit er in jouw sample zit.
• Bij een FACS-analyse gebruik je een antistof die kan binden aan de eiwitten op het celoppervlak.
Dit kun je dan aflezen. Je weet dan of cellen dit eiwit hebben (door gebruik antistof tegen dat
eiwit) en welke cellen dit zijn, doordat je nog een andere marker meeneemt. Dit kun je doen in
een stukje weefsel.
,• Bij een Western Blot maak je een bepaald eiwit zichtbaar. Deze techniek kan je hier alleen
gebruiken als je een stukje weefsel selecteert waarvan je zeker weet dat het tumorcellen bevat.
Als je dit niet doet dan kijk je niet direct naar tumor geassocieerde eiwitten
3. Na het doen van dit experiment blijkt dat PD-L1 toch wel op medulloblastoom cellen aanwezig is.
Vervolgonderzoek geeft namelijk aan dat het PD-L1 bindt aan een nieuw geïdentificeerd eiwit
(genaamd PA-2017) wat ervoor zorgt dat de bindingsplaats van de antistof gebruikt in IHC wordt
gemaskeerd. U wilt weten of PA-2017 binding aan PD-L1 een belangrijke rol speelt in PD-L1 functie.
Hoe gaat u te werk om dit te onderzoeken? (6 pnt)
Je zou een knockout kunnen maken van PA-2017. Hierdoor kun je het gedrag van PD-L1 met en
zonder PA-2017 analyseren en kun je dus erachter komen of PA-2017 een belangrijke rol speelt in de
PD-L1 functie. In de knockout ga je de killing van de tumorcellen door T-cellen meten (read-out =
killing van tumorcellen door T-cellen). De knockout kun je maken mbv van CRISPR Cas,
siRNA/microRNA/shRNA (die binden aan het mRNA waardoor het mRNA niet afgelezen kan worden
en geen eiwit meer kan vormen, dit is tijdelijke knockdown).
Verder zou je een PA-2017 kunnen overexpressen. Je zult dan het omgekeerde fenotype krijgen als
het goed is. De read-out blijft de killing van de tumorcellen. Dit kun je doen door een plasmide met
een verhoogde promotor te infecteren. Dit is een tijdelijke manier om te zorgen voor overexpressie.
→ Om het belang van een eiwit te bestuderen kun je altijd in verschillende read-out contexten een
knockout en overexpressie maken.
4. Uit dit onderzoek blijkt dat de binding van PA-2017 aan PD-L1 essentieel is voor de functie van
PD-L1. Ook blijkt dat PA-2017 wordt gemaakt en uitgescheiden door hepatocyten in de lever. U
wordt enthousiast en ziet een nieuwe therapeutische toepassing voor behandeling van
medulloblastomen (anders dan PD-L1 blokkers). Beschrijf kort hoe u een dergelijk nieuw medicijn
zou ontwikkelen (5 pnt) en hoe u deze uiteindelijk gaat testen in vivo (3 pnt)
Je zou een synthetische variant kunnen gaan inspuiten. Verder kan je het gen in een plasmide in een
bacterie plaatsen, waardoor de bacterie grote hoeveelheden van PA-2017 kan vormen. Deze kun je
daarna uit het medium zuiveren waaraan ze zijn afgegeven. Hierdoor kun je de functie van PA-2017
nabootsen. Je moet wel verschillende methoden testen om te kijken of het eiwit nog functioneel
blijft.
Als je juist van een eiwit af wilt kan je deze blokkeren door specifieke inhibitors toe te dienen. Je kan
ook een eiwit maken die concurreert voor de bindingsplaats op PD-L1 met PA-2017. Hierdoor kan er
minder PA-2017 aan PD-L1 binden. Verder kun je een antistof toedienen om te zorgen dat het eiwit
geblokkeerd wordt. Je kunt dit synthetisch doen of je geeft het eiwit/antigen aan een ander dier. Dan
kun je het dier de antistoffen filteren. Het dier zal vaak een muis zijn, omdat deze hybridomas vormt.
Je krijgt een fusie van een B-cel met een tumorcel, hierdoor kan de cel eindeloos delen. Uiteindelijk
krijg je dus allemaal monoklonale antistoffen. Bij veel andere dieren kun je alleen poly-klonale
antistoffen maken. Je mimickt dus de bindingsplaats, en die kan je als competiter toevoegen.
,HC: ONDERZOEKSMETHODEN II
Oefenvraag
U doet onderzoek naar taaislijmziekte (cystic fibrosis, CF). Na genetisch onderzoek van een patiënt
met taaislijm wordt de differentiaal diagnose CF gegeven. De puntmutatie die u heeft ontdekt in het
CTFR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) gen blijkt nieuw te zijn, er zijn geen
andere patiënten bekend met deze mutatie. De overige nucleotidenparen in het CTFR gen zijn niet
gemuteerd. Het expressie level (mRNA) van het mutant CTFR eiwit is onveranderd. Ook de
hoeveelheid eiwit en de lokalisatie in de celmembraan van het mutant CTFR zijn normaal.
Eiwitkristallografie laat zien dat het mutant CTFR ook gewoon goed gevouwen is.
1. U wilt in vitro aantonen dat de gevonden nieuwe mutatie in CTFR inderdaad leidt tot een defect
in chloride huishouding. U heeft alleen een biopt van darmcellen (inclusief de stamcellen) van een
gezonde vrijwilliger tot uw beschikking. Hoe gaat u te werk? (2 pnt)
Je gaat een mutatie inbrengen in de gezonde darmcellen. Deze mutatie kan worden aangebracht met
behulp van CRISPR-Cas. Hierbij is de functionele read out de chloortransport. Met deze read-out kan
je de mutant met het wildtype gaan vergelijken. Je had ook organoïds kunnen maken met behulp van
de stamcellen. Je had dan hierop de chloortransport kunnen meten en die tussen wildtype en mutant
kunnen vergelijken.
Een alternatief om een mutant te bestuderen is het gebruik maken van Hela cellen waar je een
plasmide met overexpressie van de mutant toevoegt. Dan vergelijk je de Hela cellen met toevoegde
plasmide (mutant) met de Hela cellen (controle).
2. Uit uw in vitro experiment blijkt inderdaad dat de gevonden mutatie in CFTR resulteert in een
defect in chloride huishouding wat de differentiaal diagnose CF waarschijnlijker maakt. In een
recente publicatie van een andere onderzoeksgroep blijkt dat zij een nieuw eiwit hebben gevonden
(genaamd PATHO2021) wat het mutant-CTFR remt. PATHO2021 wordt gemaakt en uitgescheiden
door slijm producerende cellen. PATHO2021 kan binden aan het gemuteerde aminozuur van
mutant-CTFR (extracellulair) en fungeert hier als een fysieke barrière voor chloride ion transport.
Wat zouden deze onderzoekers gedaan kunnen hebben in het lab om het nieuwe eiwit PATHO2021
te identificeren en op het spoor te komen in deze context? (3 pnt)
Je zou een pull down experiment kunnen uitvoeren. Hierbij breng je je mutant-CTFR aan op een
membraan via vesicles. Dan voeg je je cellysaat/medium met de verschillende eiwitten (waaronder
PATHO2021) toe. Deze eiwitten kunnen gaan plakken aan de mutant-CTFR. Dan was je de niet
gebonden eiwitten weg. Uiteindelijk kijk je wat gebonden was door dit vergelijken met de wildtype.
Met massaspectrometie kan je de gevonden eiwitten detecteren m.b.v. de time of flight. Je hebt
hierbij 2 mogelijkheden: eiwit in stukjes knippen (peptiden) met trypsine en dan een spectrum van
peptiden krijgen die specifiek is voor elk eiwit of die peptiden ook weer in aminozuren knippen en
dan krijg je een sequentie die specifiek is voor elk eiwit. Massaspectrometie wordt dus gebruikt om
eiwitten te achterhalen!
3. U vraagt zich af hoe belangrijk PATHO2021 binding aan mutant-CTFR is in het disfunctioneren
van CTFR. Beschrijf twee manieren om de directe relevantie van PATHO2021 te onderzoeken in de
pathogenese van CF in vivo (diermodel)? (2 pnt)
Je kan een knockout muis maken van PATHO2021. Je kan dan het verschil zoeken tussen het wildtype
en de mutant door te kijken naar de chloorhuishouding. Een voorwaarde is dan wel dat je een
mutatie in het chloorkanaal (CTFR-mutant) moet aanbrengen in beide muizen. De read-out is een
waarde waarmee je CF kunt meten, bijvoorbeeld slijmvorming. Je had ook een reporter muis kunnen
gebruiken, deze krijgt fluorescente cellen als een bepaalde actie wel ten uiting komt.
Ook zou je overexpressie van PATHO2021 kunnen induceren met CRISPR-cas waarbij je de promotor
bijvoorbeeld sterker maakt of het gen dupliceert of RNA afbraak tegengaan of een virale promotor
(promotor staat altijd aan). Je verwacht dan juist het tegenovergestelde resultaat.
, 4. Uit uw in vivo experiment blijkt dat PATHO2021 inderdaad een essentiële rol speelt in CF door
direct te binden aan mutant-CTFR en zo het chloride transport te blokkeren. Om uw patiënt te
kunnen helpen wilt u op basis hiervan een gepersonaliseerde therapie / medicijn ontwikkelen.
Beschrijf hoe u een dergelijk medicijn zou ontwikkelen (2 pnt) en hoe u deze uiteindelijk gaat testen
in vivo (1 pnt).
Je zou een peptide kunnen laten binden aan het mutanten kanaal, waardoor je PATHO2021
wegcompeteert. Deze peptide moet alleen niet het kanaal blokkeren, dus je moet de bindingssite
van het mutante eiwit weten. Dit kan je doen via eiwitkristallografie, waardoor je de structuur en
vooral de binding tussen het complex achterhaald. Bij een eiwit eiwit interactie is het namelijk niet
dat één aminozuur één ander aminozuur bindt, maar je hebt meerdere contactpunten verspreidt
over het molecuul. Met behulp van de diffractie van de straling kun je een idee krijgen van de
structuur en vouwing van een eiwit. Ook zou je het peptide uit CTFR kunnen halen, die gaat dan
competeren met PATHO2021. Soms weet je niet wat het effect is van het blokkeren van PATHO2021,
het zou voor bijwerkingen kunnen zorgen. Daarom test je eerst op toxiciteit, dan op een
uitbehandelde groep en dan heb je grotere onderzoeken (clinical trails).
Verder zou je therapeutisch een antilichaam tegen PATHO2021 kunnen toedienen. Deze moet de
binding blokkeren tussen CFRE en PATHO2021, maar niet de functie van CTFR in de weg zitten. Dus
hij moet niet het chloorkanaal blokkeren, maar alleen de bindingsplek. Als je alleen PATHO2021
wegvangt dan zal de functie van CTFR minder snel geblokkeerd worden. Je moet dus wel mono-
klonale antlichamen maken.
Ook zou je met CRISPR-cas de mutant kunnen aanpassen. Je zou dan de stamcellen met een gezonde
CTFR gen kunnen maken. Dan heb je gezonde stamcellen die zorgen voor een gezonde
slijmproductie.
Oefenvraag
U doet onderzoek naar de pathogenese van acute ontstekingen. Middels een proteomics
(massaspectrometie, MS) benadering in een weefsel met acute ontsteking lijkt het erop dat u een
nieuw eiwit heeft ontdekt wat sterk lijkt op het cytokine IL-1. Dit nieuwe cytokine geeft u de naam
PATHO-2015. IL-1 wordt met name door macrofagen gemaakt en zorgt voor een versterking van de
ontstekingsrespons. IL-1 stimuleert bijvoorbeeld de expressie van selectines en andere
adhesiemoleculen op endotheel cellen, wat leidt tot de migratie van neutrofielen in het
ontstekingsgebied. U wilt de rol van uw nieuw geïdentificeerde eiwit PATHO2015 verder
onderzoeken.
1. Om uw proteomics (MS) resultaat te bevestigen, wilt u op alternatieve wijzen onderzoeken of
PATHO2015 spiegels stijgen in het bloed van patiënten met een overmatige acute
ontstekingsrespons. U heeft hiervoor een cohort serum samples van sepsis patiënten (+ gezonde
controles) tot uw beschikking. Om de resultaten goed te onderbouwen wilt u op 2 manieren
PATHO2015 gaan meten in serum, waarvan tenminste 1 op een kwantitatieve manier. Welke 2
manieren stelt u voor? (5 pnt)
• ELISA -> kwantitatief
• Western Blot (bandje ja of nee?) -> semi-kwantitatief
2. U heeft aanwijzingen dat PATHO2015 werkt via een directe interactie met een specifieke
receptor op het oppervlak van endotheelcellen. Omdat PATHO2015 homologie vertoont met IL-1
heeft u eerst de IL-1 receptor getest. Deze bleek het niet te zijn. Hoe gat u in het lab de juiste
PATHO2015 receptor identificeren? (5 pnt)
Je kan een pool down uitvoeren. Je houdt dan PATHO2015 vast op bolletjes en membraanextracten
van endotheelcellen laat je er langs lopen. Daarna kijk je wat eraan gebonden is en doe je een MS-
analyse. Hierbij nemen we aan dat er specifieke antilichamen zijn voor dit eiwit.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller fleurheling. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.07. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
62890 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now