OMICS in de biomedische wetenschappen (5052OIB12Y) (5052OIB12Y)
All documents for this subject (2)
Seller
Follow
lucavaneick
Reviews received
Content preview
Hoorcollege 10 Inleiding proteomics
DNA is redelijk makkelijk te begrijpen. RNA is veel lastiger.
Want snel afgebroken door RNAses, maar ook nog
veranderingen in RNA molecuul. Hebt bijvoorbeeld splicing
of methylatie.
Bij eiwitten nog veel ingewikkelder. De aminozuren van het
eiwit bestaan uit 20 soorten, en allemaal heel verschillende
eigenschappen. Dus eiwitten lastig te bestuderen. Kunnen
ook degraderen of denatureren. Of kunnen hydrolyseren. Zijn ook veel
posttranslationele modificaties die mogelijk zijn, en verschilt ook per aminozuur.
Dynamic range is heel belangrijk; van sommige eiwitten
maar een paar en sommige een paar honderd, dus verschilt
heel veel. Maximale wat je kan analyseren is 10 4
Metabolimics heeft ook veel verschillende chemische
bindingen. Dynamic range is ook erg groot.
Proteomics = identificatie, characterisatie en kwantificatie
van eiwitten
- Hele cellen
- Specifieke biologische compartimenten
- Subcellulaire fracties
- Geïsoleerde eiwitten en eiwit complexen
Mass spectrometry is DE grootste proteomics tool
Eiwitten bestaan uit 20 natuurlijke aminozuren. Zijn natuurlijk omdat ze tijdens
translatie in ribosoom direct kunnen worden ingebouwd. Zijn aan elkaar
gebouwd via peptide bindingen. En hebben allemaal andere eigenschappen.
Sommige zijn erg hydrofoob (trypsine?) en sommige heel hydrofiel (arginine)
Speciaal UGA; selocysteine
Speciaal UAG; pyro-lysine (niet in mensen)
De zijgroep verschilt per aminozuur. En sommige komen meer voor dan andere.
Lysine is veelvoorkomend maar bijvoorbeeld tryptofaan juist heel weinig.
Eiwit structuur
- Primaire structuur = opeenvolging van aminozuren
- Secundaire structuur = alfa helix en bèta sheets door hydrogene
bindingen in peptide backbone
- Tertiaire structuur = vouwing van enkel eiwit
- Quaternaire structuur = samenvouwen van meerdere eiwitten
Eiwitten in oplossing altijd geladen, sommige positief (arginine/lysine) en
sommige negatief (…. Staat in tabel!!).
,Hydrofoob ezelsbruggetje
- In vouwing allemaal aan de binnenkant
o Zijn wel uitzonderingen
o Proline en cysteïne
Cysteïne meer aan binnenkant, want nodig voor vouwing van
eiwit via S-S bruggen. Dit zorgt voor stabilisatie
Proline meer aan de buitenkant, want is een structuur breker.
Kan niet goed deelnemen aan alfa helix of bèta sheet.
Resonantie peptide binding
- Amino stikstof kan elektronen delokaliseren ? DIA
- Kan bij dubbele binding niet roteren (rigiditeit), maar bij enkele wel. Dus
krijgt soort vlak. En sommige conformaties zijn onmogelijk afhankelijk van
Psi en Phi hoek. Sommige waterstof atomen komen dan te dicht bij
elkaar.
- Krijgt in eiwitstructuren bepaalde conformaties heel vaak voor en
sommige helemaal niet
Prion eiwitten kunnen omslag maken van structuur met voornamelijk alfa helixen
naar structuur met vooral bèta sheets. Tweede structuur is toch iets stabieler, en
kunnen dan kettingreactie aanwakkeren dat alle eiwitten die omslag maken. Wat
zorgt voor aggregaten en verschillende ziektebeelden
Krachten op eiwit structuur (UITLEG OP DIA)
- Hydrogen bond
- Hydrofobe kracht
- Van der Waals
Analyse met of zonder pre-purificatie (denaturatie noodzakelijk)
- Eerst sample prepareren en dan kan je zuiveren op ladingsverdeling.
Zuivert aan hand van stroom; iso electric focussing (IEF). Laat bewegen
in pH gradiënt, dus steeds moeilijker om te bewegen. Dus komt op
gegeven moment stil te staan wat net lading is 0. Waardoor ze gescheiden
zijn per eiwit.
- Daarna ook nog scheiden op grootte (2e dimensie)
- Doet daarna mass spectrometry om bepaald spotje te analyseren
o Ioniseerd tot gas fase
o Scheid op basis van mass/charge (m/z) ratio
o Ionen gedetecteerd en m/z van ionen bepaald
o Signaal is niet proportioneel tot sample. Afhankelijk van ionizatie
efficiëntie. Dus niet makkelijk om quantificatie te doen met ms
- Matrix-assited laser desorptsion ionization (MALDI)
o Sample in ligt absorberende matrix gedaan
o Omliggende moleculen geëxciteerd door laser, geven dan protonen
af. kunnen landen op peptide en kunnen dan gemeten worden bij
ms
o Nauwkeurig massa’s van peptiden berekenen
o Time of flight (TOF); uit tijd van detectie kan je massa afleiden
o In m/z is z altijd 1, want maar 1 proton aanwezig
o Krijgt verschillende hoeveelheden van peptide want eiwitten
ionizeren niet altijd even goed
2
, o En komen ook isotopen voor van de peptides, dus hoe groter de
peptides zijn hoe meer kans er is op een C13 i.p.v. C12 in je peptide
- Peptide mass fingerprinting
o Eiwit gedigesteerd met trypsine
o Mass analyse van peptiden
o Vergelijken met database
o Kan niet alle stukken terugvinden, komt door ionizatie efficiëntie. Of
je herkent een deel niet, kan bijvoorbeeld komen door modificaties.
Is enige manier om zeker te weten dat peptide gefosforyleerd is
- ElectroSpray Ionization (ESI) MS
o Sample solutie uit capilair
o Droplets verdampen en eiwitten/peptiden gaan mass analyser in als
multi geladen ionen
o Gescheiden aan hand van m/z waarde
o Detectie
o Mass spectrum (deconvolutie tot z=1)
o Verschil maldi; als je een heel makkelijk ionizeerbaar peptide
tegenkomt kunnen ze ook meer protonen hebben, wat niet zo is bij
maldi
o Kan in isotoop grafiek zien of het 2+ of 3+ lading is tussen
pieken 0.5 of 0.33 m/z verschil ?????? (kijken op dia)
Fragmentatie (ms/ms)
- Hebt precursor ion en product ion(en)
- Uit product massa kan je iets te weten komen over chemische constructie
precursor massa
- Uit botsing patronen genoeg informatie om sequentie op te maken
- Kan ook eiwitten door elkaar heen analyseren, sommige delen peptide
backbone zijn namelijk veel fragieler dan andere
- Bij vrijwel alle botsing methoden zijn B en Y ionen meest stabiel dus zie je
meest voorbij komen, kan aan hand van die ionen hele sequentie afleiden.
o Y ion is met carboxy kant er nog aan
Probleem kwantificatie
- Hangt af van ionizatie efficiency
- Kan massa labels eraan hangen om relatief goed te kunnen kijken,
beïnvloed niet ionizatie efficiency
o SILAC label; op cel of weefsel niveau
o ICPL label; op eiwit niveau
o ITRAQ Label; op peptide niveau
- Kan ook zonder label werken. Purificatie is dan zo nauwkeurig gedaan dat
niet nodig is
Protein arrays; targeted (biased)
3
, - Wilt verschillend gereguleerde eiwitten in bepaalde condities vergelijken
of naar samenwerking van eiwitten kijken
- Kan alleen kijken met antilichamen die je daarvoor hebt geselecteerd
Toepassing van proteomics
- Identificatie van eiwitten die gereguleerd worden door Hfq bij neisseria
meningitidis. Zeldzaam want vaak niet schadelijk. Maar als fout gaat dan
is het heel ernstig
- Is gram negatieve bacterie die door veel mensen bij zich gedragen worden
- Hebt verschillende subgroepen met andere capsules die beschermen
tegen immuunsysteem
- Hfq beïnvloed posttranscriptionele regulatie via small RNA’s
- Wilt dus Hfq lokaliseren en dan uitknocken
- Doet proteomic comparisson verschillende eiwitten tot expressie
- Geeft inzicht in hoe het betrokken is de ziekte
MSe sequensen; niet selecteren voor peptiden maar gewoon alles wat
langskomt
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller lucavaneick. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $6.44. You're not tied to anything after your purchase.
