Volledige samenvatting Hoofdstuk 8 methoden in het biomedisch onderzoek 3
10 views 0 purchase
Course
(E0F95A)
Institution
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Volledige samenvatting hoofdstuk 8 van methoden in het biomedisch onderzoek 3. Hoge punten al bewezen na gebruik van deze samenvatting, 16+/20!
Dirk zijn lessen ontcijferd tot een doorlopend verhaal dat heel begrijpbaar is.
Contents
8. Modulatie van genexpressie ............................................................................................................... 2
8.1 Onderdrukking van genexpressie via antisense technologie ........................................................ 2
8.1.1. Antisense oligonucleotiden ................................................................................................... 2
8.1.2. RNA interference (RNAi) ........................................................................................................ 3
8.2. Gendisruptie, mutagenese en editing .......................................................................................... 6
8.2.1. Transposons........................................................................................................................... 6
8.2.2. Site Specific DNA recombinatie ............................................................................................. 9
8.2.3. Mutagenese ......................................................................................................................... 11
8.2.4. CRISPR.................................................................................................................................. 13
8.3. Ectopische expressie en overexpressie ...................................................................................... 28
8.3.1. Directe injectie van mRNA................................................................................................... 28
8.3.2. DNA vectoren ...................................................................................................................... 28
8.4. Gerichte proteïne degradatie ..................................................................................................... 30
8.4.1. Conditionele degrons .......................................................................................................... 31
8.4.2. Bifunctionele moleculen: PROTACs ..................................................................................... 32
8.4.3. TRIM away ........................................................................................................................... 32
8.5. Methoden van gentransfer ........................................................................................................ 33
8.5.1. Transfectie ........................................................................................................................... 33
8.5.2. Transductie .......................................................................................................................... 36
,8. Modulatie van genexpressie
DOEL:
- Functie en rol van eiwitten in fysiologie en pathologie bestuderen
- Doelwitten identificeren voor ontwikkelen van medicijnen die functie van genproducten
moduleren
8.1 Onderdrukking van genexpressie via antisense technologie
PRINCIPE:
- Gebaseerd op Watson-Crick base paring met mRNA sequentie
- 2 verschillende methodologiën
o Antisense oligonucleotiden (ASO)
o RNA interference (RNAi)
8.1.1. Antisense oligonucleotiden
Kort (8-50nt) enkelstrengig DNA (ssDNA) gericht tegen mRNA van gen waarvan men expressie wil
downmoduleren. RNA/DNA duplex. Onderdrukking van genexpressie via 3 complementaire
mechanismen.
- Approach 1: op niveau van pre-mRNA: gericht tegen
splicing motieven, poly-adenylation signaal.
- Approach 2: op niveau van mature mRNA:
o a) blockage van ribosome binding site, 5’ cap site,
translatie initiatie site
o b) RNase-H-afhankelijke target mRNA degradatie.
- Barrières voor toepassing:
o Opname in de cel en weefsel distributie moeilijk voor oligonucleotiden, opl.’en:
▪ Chemische modificaties: conjugatie met N-acetylgalactosamine (GalNac)
▪ Polymere nanopartikels: Poly lactic-co-glycolic acid (PLGA)
▪ Lipiden
o Stabiliteit: afbraak door nucleases, oplosssing voor bescherming tegen degradatie:
▪ Chemische modificaties: in phosphonate, suiker, base
o Toxiciteit
,8.1.2. RNA interference (RNAi)
RNA interferentie is het proces waarbij de expressie van een doelwitgen onderdrukt wordt door de
selectieve inactivatie van het mRNA door dsRNA. dsRNA wordt geprocessed tot ssRNA dat dan kan
hybridiseren met het doelwit mRNA. Dit is een proces dat reeds natuurlijk voorkomt in de cellen. (zie
ook miRNA)
Mechanisme van RNA interferentie:
, ➔(152) RNA interference (RNAi): by Nature Video - YouTube
siRNA zijn afgeleid van langere dsRNA die ofwel geproduceerd worden in de cel zelf of experimenteel
in de cel zijn binnen gebracht. De introductie van siRNA of dsRNA is veel gebruikt om gen expressie te
manipuleren. miRNA zijn een andere soort van RNA, de meeste miRNA komen van RNA’s die
getranscripteerd zijn in de nucleus, waar ze vouwen en geprocessed worden voor ze in het cytoplasma
terecht komen als double-stranded-precursor-microRNA’s.
De dubbelstrengige precursors van miRNA en siRNA binden aan Dicer, een endonuclease dat RNA knipt
in kleinere fragmenten. De meeste siRNAs en miRNAs zijn gemiddeld 21 nt lang. Het korte dsRNA bindt
dan een Argonaut proteïne (AGO2). 1 streng is geselecteerd en blijft gebonden aan het Argonaut, dit
is de guide-streng, de andere streng komt los en wordt gedegradeert. De combinatie van het RNA,
Argonaut en andere proteïnen noemen we het RNA-induced-silencing-complex of RISC.
siRNAs sturen RISC om te binden aan specifieke mRNAs. De targetting is specifiek want wordt bepaald
door de baseparen tussen het siRNA en het target mRNA. siRNAs hebben vaak perfecte
complementariteit met hun targetsites. Eens gebonden katalyseert Argonaut de knipping van het
mRNA, waardoor het mRNA dan gedegradeerd zal worden.
miRNAs sturen ook RISC naar mRNAs, meestal is maar een deel van de miRNA complementair met het
doelwit mRNA. Deze niet perfecte matching maakt het miRNA mogelijk om vele verschillende mRNAs
te targetten! Targeting via miRNA kan leiden tot de degradatie van mRNA of de inhibitie van de
translatie.
siRNA structuur:
- Commercieel verkijgbaar: custom of pre-designed, al dan niet gevalideerd (alternatief: In Vitro
transcriptie)
- Accumuleren voornamelijk in cytoplasma
- Knock-down is transiënt
- Delivery: verschillende methoden
Off-target effecten door interactie met de natuurlijke miRNA pathways
o miRNA niet 100% complementariteit nodig, aspecifieke downregulatie mogelijk
Immuunstimulatie als reactie op lang dsRNA of op delivery vesikel => algemene onderdrukking
van eiwitsynthese
Stabiliteit: onderhevig aan afbraak door nucleases
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller lukanys11. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.00. You're not tied to anything after your purchase.
