Dit document bevat een volledige samenvatting van gevorderde moleculaire biologie. Tijdens het samenstellen van deze samenvatting heb ik gebruik gemaakt van powerpoint informatie, uitgebreide notities (bij elk woord dat hij verteld) en tot slot aangevuld met notities en samenvattingen van vorige ja...
Hoofdstuk 1: Nucleus genoom 3D organisatie
1 Nucleaire compartimentalisatie
Een nucleus is geen aquarium waar alles ongeordend in rond drijft. We kunnen kijken in de kern waar
de chromosomen bewaard zijn en dit is niet random. De chromosomen zijn ook beschermd op deze
manier. Sommigen genen zijn niet nodig in bepaalde cellen, bijvoorbeeld hersencellen expresseren
andere genen dan bloedcellen. Alleen de actieve genen moeten makkelijk toegankelijk zijn en de rest
kan iets meer opgeborgen zijn. Sommige dingen die men veel nodig heeft of vooral vaak samen nodig
heeft, gaan samen in een vesikel zitten. Die compartimentalisatie zorgt er voor dat bepaalde processen
makkelijker kunnen doorgaan.
Het genoom van een eukaryote cel is 1000x zo groot als dat van een bacterie. Hoe meer DNA materiaal,
hoe meer nood er is voor mechanismen voor het klasseren van alle informatie.
Als we DNA kleuren in de verschillende chromosomen dan zien we verschillende domeinen. Er zijn
verschillende DNA niveaus:
1. Dubbele DNA helix
2. Helix opgerold rond nucleosomen
3. Lussen die bij elkaar worden gehouden door
eiwitten
4. Die lussen zijn niet random maar
georganiseerd in domeinen, namelijk TAD’s
(topalogical associated domains). Daarin
hebben we lussen die een co-regulatie
vertonen (zelfde transcriptiefactoren bv)
5. LADs (= lamine associated domains): Dit zijn
TAD’s geassocieerd met de nucleaire lamina.
De nucleaire lamina bestaat uit lamines en hieraan DNA binden. Lamines kunnen beschadigd
worden, dit kan er voor zorgen dat de chromatine eiwitten de greep verliezen op de lamine
structuur → die LAD wordt dan per ongeluk een TAD met de gevolgen van dien. Dat dynamisch
proces tussen TAD’s en LAD’s naar elkaar, wordt ook streng gereguleerd. Zo wordt er ook
gesproken van de 4D nucleoom organisatie en dit is de 3D organisatie maar in functie van tijd.
Wat bepaald of je DNA in een TAD of LAD zit? Die chromatine eiwitten kunnen sterk gemodificeerd
worden, zoals acetylatie van histonen. Dus dit wordt dus gereguleerd door post translationele
modificaties.
2 Nucleaire fluïditeit: chromatine fase seperatie
Het nucleoplasma is geen homogene vloeistof, maar heeft
dus een bepaalde viscositeit. Sommigen componenten zijn
heel waterig, andere iets meer vettig. De celkern is een
vetsuspensie, we hebben daar vetdruppels in een waterige
vloeistof. Dit noemt men nuclear bodies of nuclear speckels
(maar die kunnen ook terug switchen), het is een soort mini
fabriek. Om deze vetdruppels in beeld te brengen, heb je
fluorescentie nodig.
,Samenvatting Gevorderde moleculaire biologie
De chromatinestructuur regelt faseveranderingen in de nucleaire fluïditeit
In die nuclear bodies zitten allemaal chromatine eiwitten die een rol
spelen bij genrepressie of -activatie. Een cel die verouderd, zal
veranderingen beginnen tonen in de samenstelling van die nuclear bodies.
Bijvoorbeeld SICCs of SAHF’s worden, naarmate de cel ouder wordt, het
meest duidelijk. Gelijktijdig verandert de nucleolus ook in vorm en
dispersie / spreiding.
De chromatinestructuur regelt faseveranderingen in de transcriptie fabrieken
De meeste genen die inactief zijn, liggen aan de periferie bij de lamines. De actieve genen zijn meestal
gelegen tegen de celkern. TAD’s kunnen dus verschillende functies hebben en kunnen ook overlappen
met elkaar, bijvoorbeeld waar veel splicefactoren zijn.
Distributie van genrijke en genarme regio’s in de nucleus is niet homogeen
Hier wordt een specifieke kleuring gebruikt die de genarme regio’s (correleert met
heterochromatine) rood kleurt en de genrijke / actieve regio’s (correleert met
euchromatine) groen. Je kan ook zien dat verschillende celtypes andere
kleurpatronen zullen weergeven, bijvoorbeeld een levercel zal voornamelijk
centraal een inactieve regio hebben en voor de rest veel actieve regio’s.
Daarentegen zal een rustende lymfocyt bijna geen actieve regio’s hebben omdat
deze in een soort “stand by” modus zit.
Vroeger heeft men fluorescente probes aangebracht in elk chromosoom om te zien hoe deze verdeeld
waren, maar ook voor afwijkingen te vinden. Tegenwoordig kan dit met Whole genome sequencing
maar zo heeft men wel gezien dat elk chromosoom zijn eigen territorium heeft.
,Samenvatting Gevorderde moleculaire biologie
3 Genoom opvouwing 3D: TADs, LADs
Nucleaire subcompartimentalisatie van actieve genoomdomeinen via lussen
Om te zien welke lussen binnen een domein co-gereguleerd zijn, kan de Chromosoom Conformatie
Capteer technologie gebruikt worden (= de drie C technologie). De technologie gaat cellen nemen
waarvan ze de lussen een soort van bevriezen door deze te crosslinken met formaldehyden. Hierdoor
gaan de eiwitten crosslinken met het DNA en dan wordt er geknipt met een restrictie enzym, gevolgd
door een ligatie stap door het T4 DNA ligase. We krijgen intramoleculaire ligatie van de twee
overblijvende stukken die nog vasthangen aan elkaar. Er wordt geen intermoleculaire ligatie (met een
andere lus) gedaan want dit zou veel langer duren dan die gewoon die kleine stukjes die toch al dicht
bij elkaar zijn te ligeren.
Dan werd een PCR gedaan om te gaan kijken wel primer paren van verschillende genen geamplificeerd
zijn. Later is men van PCR naar NGS gegaan. Er is nog een 4, 5 en 6 C met hetzelfde principe maar met
een ander detectiesysteem waardoor je meer dingen te weten kon komen. Nu zitten we op het
stadium waar 3C, HI-C technologie wordt genoemd. Dit betekent dat we het hele genoom in kaart
kunnen brengen op vlak van welke fragmenten met elkaar interageren. In deze “kaart” wordt het
genoom als een lineaire sequentie voorgesteld en al die blokjes die je ziet = DNA fragmenten die een
interactie aan gaan met een ander DNA fragment. Dit is symmetrisch en hierdoor kunnen de resultaten
van 3C technologieën weergegeven worden in driehoeken. Zo’n driehoek is gewoon dat vierkant van
daarjuist maar dan de helft. In zo’n HI-C voorstelling kan je verschillende resoluties hebben. Hoe meer
genen je hebt, hoe kleiner de blokjes dus hoe hoger de resolutie maar ook hoe duurder het wordt.
Zo’n 3C technologie kan ook gebruikt worden om te kijken wat er mis is bij een ontwikkelingsstoornis.
Er zijn een heleboel syndromen waarbij men geen mutatie vindt. Hier heeft men bij een bepaald aantal
aandoening gevonden dat er iets mis is bij die vorming van lussen → dan loopt er iets mis in zo’n TAD
met een probleem in de organese of ontwikkeling van de ledematen tot gevolg. Dit is best nieuw want
we dachten dat mutaties in de sequentievolgorde voldoende waren om ziekten te gaan verklaren,
maar heel veel complexe ziektes kunnen we niet genetisch verklaren. Nu blijkt dat de 3D organisatie
van het genoom daar ook een grote rol in speelt.
, Samenvatting Gevorderde moleculaire biologie
Nucleaire lamine eiwitten
De lamines zitten in de nucleaire lamina en ze zorgen voor de stevigheid van de nucleaire membraan.
Dan hebben we nucleaire poriën en die blauwachtige en grijze wolken zijn chromatine eiwitten die
gelinked zijn aan ons chromosoom. Dus tussen de nucleaire poriën hebben we verankerpunten voor
het chromatine via de lamines.
Mutaties in de nucleaire lamina veroorzaken Progeria (verouderingsziekte). De stevigheid van de
nucleaire membraan en dus ook de lamine organisatie is volledig verstoord. Er is een cryptische
mutatie (er ontbreekt een stukje) in Lamine A. Dit heeft bepaalde gevolgen: de stevigheid
van de nucleus is weg, de chromatine structuur is verstoord net zoals een heleboel
nucleaire organisatie mechanisme waaronder ook het DNA herstel mechanisme. Dit
proces gebeurt ook in gezonde mensen maar dit duurt 7x langer.
Rol nucleaire mechanosensing in 3D genoomopvouwing
We weten dat het cytoskelet van de celkern zorgt voor stevigheid. Het nucleoskelet staat in contact
met het cytoskelet. Cellen zijn soms onderhevig aan mechanische stress, als je bijvoorbeeld nu op je
huid duwt dan wordt de celkern ingedrukt. Maar ze hebben een bepaalde elasticiteit zodat er geen
er breuken en DNA schade ontstaan door mechanische stress. Dus ook de TAD en LAD organisatie
gaat veranderen onder mechanische stress. De lamine eiwitten gaan als een transducer fungeren van
mechanisme stress.
Mechanosensing van extracellulaire signalen vanuit de micro-omgeving resulteren in activatie van
bepaalde transcriptiefactoren en modulatie van cytoskelet-nucleus linken waardoor er ook een
bepaalde chromatine organisatie gebeurt. Die ruimtelijke chromatine organisatie en post-
translationele modificaties zijn essentieel voor het leiden van transcriptiefactoren naar hun target
genen. Dus verlies in zo’n ruimtelijke chromatine configuraties kan leiden tot transdifferentiatie en
aanvang van verschillende ziekten.
De cel is in staat om verschillende vormen aan te nemen maar de chromatine organisatie zal
verschillen. Dit komt door contacten van integrines met het cytoskelet en dan gaat het cytoskelet
contact maken met lamine eiwitten. Die mechanische stress wordt dus doorgegeven. Het cytoskelet
bestaat uit actine eiwitten, microtubuli en intermediaire filamenten. De lamine eiwitten staan
daarmee dus in contact via nesprine, dit is een soort crosslinker tussen het nucleoskelet en het
cytoskelet.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller lentev1203. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $18.23. You're not tied to anything after your purchase.
