Se establecen conceptos y aplicaciones respecto a las Proteínas, sus bases de separación por medio de diferentes técnicas como por ejemplo, la Cromatografía de filtración en gel, Cromatografía por afinidad, Cromatografía por intercambio iónico. Etc
1. ¿Qué tipo de técnicas de homogenización están disponibles para solubilizar
una proteína?
TECNICAS DE HOMOGENIZACION
- Moler la célula en licuadora con una
solución amortiguadora. Así se liberan
las proteínas solubles
- Homogenizar en el homogenizador
Potter Zluelhjen.
- Sonificación
- Congelación y descongelación
2. ¿Qué se quiere decir con extracción por precipitación salina? (Salting out)
La precipitacion salina (Salting out) varia conforme se cambie la concentracion salina y
se utilice un tipo de sal requerida para el proceso o precipitacion, el cual varia de soluto a
soluto. Esta tecnica tiene como objetivo la separacion de las proteinas y el plasma presentes
en la sangre por medio del compuesto de sultato de amonio ((NH₄)₂SO₄), el cual esta
basado en la eliminacion de partes de agua de la proteina para formar los enlaces ion –
dipolo con sales, generando que solutos como algunas proteinas contaminantes y polimeros
puedan reaccionar entre si dado a sus enlaces hidrofobicos, donde al centifugar podremos
descontar el producto, para finalmente añadir mas sal con el proposito de precipitar otra
logrando obtener nuestra proteina de interes.
3. ¿De qué forma podría aislarse las mitocondrias de las células del hígado
, usando centrifugación diferencial?
Las mitocondrias de las celulas del higado se pueden aislar por el metodo de
centrifugacion diferencial, ultilizando la muestra necesaria para llevar a cabo su
centrifugacion a 600 veces la fuerza de la gravedad. Esto hara que se clasifiquen las
particulas por su tamaño, es decir, las partículas más grandes y densas con la mayor
velocidad de sedimentación comprenderán el gránulo durante el giro inicial de baja fuerza,
mientras que las partículas más pequeñas y menos densas permanecerán en el sobrenadante,
formando la llamada pastilla (pellet) que cuenta con células y núcleos sin romper. Hay que
tener en cuenta que, se elimina el núcleo si la proteína no se encuentra en él. Sin embargo,
tanto el sedimento como el sobrenadante se pueden separar, donde el sobrenadante puede
entrar nuevamente a realizar el proceso de centrifugacion el cual se puede realizar cuantas
veces sean necesarias para aislar cada grupo de partículas deseado. La nueva centrifugacion
se hara con 15000 veces la fuerza de la gravedad, con la finalidad de bajar las mitocondrias.
Este proceso se logra, debido a la propiedad de solubilidad que presenta la proteina, donde
nuestro resultado estara parcialmente purificado, debido a que, durante la segunda
centrifugacion, las mitocondrias y los nucleos se habian eliminado previamente.
4. Suponga que está purificando una proteína por primera vez. Ya la ha
solubilizado homogenizándola en una licuadora, seguida de centrifugación
diferencial. Ahora quiere tratar de precipitarla con sulfato de amonio como paso
siguiente. No sabe nada acerca de la cantidad de sulfato que hay que añadir, diseñe un
experimento para encontrar la concentración adecuada del sulfato de amonio que
necesita. (Como % de saturación)
En la precipitacion de sal, se utiliza el sultato de amonio ((NH₄)₂SO₄), que se basa en el
hecho de que a altas concentraciones de sal supera la tendencia natural de las proteínas a no
agregarse, ya que se neutralizan las cargas superficiales, generando que la proteina se pueda
precipitar con una mayor facilidad, debido a la union entre ellas y a la formacion de
grandes complejos. Podemos pasar a una preparación de 50% de saturación sencillamente
agregando un volumen igual de sulfato de amonio saturado. Ahora, si deseamos preparar
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