TEMA 13: INGENIERÍA GENÉTICA
La ingeniería genética es un conjunto de técnicas que permiten manipular y transferir los genes de un organismo a
otro. De este modo, se obtienen organismos genéticamente modificados.
Para transferir los genes de un organismo a otro, necesitaremos obtener la secuencia de ADN recombinante, obtener
cantidades suficientes de recombinante e introducir el ADN recombinante en un organismo vivo. Vamos a ver algunos
detalles de cada uno de estos tres procesos:
OBTENCIÓN DE LAS SECUENCIAS DE ADN RECOMBINANTE
Las herramientas básicas para la construcción de moléculas de ADN
recombinante (procedente de otros organismos) son las endonucleasas
de restricción y las ADN ligasas:
- Las endonucleasas de restricción son enzimas sintetizadas por
bacterias, que son capaces de cortar en fragmentos el ADN de
cualquier organismo.
- Las ADN ligasas unen los extremos cohesivos de los fragmentos
de ADN generados por las endonucleasas de restricción.
OBTENCIÓN DE CANTIDADES SUFICIENTES DE ADN RECOMBINANTE
Una vez obtenidos los fragmentos de ADN recombinante con el que se quiere trabajar, el siguiente paso será conseguir
un volumen de fragmentos que nos permita, a la hora de generar organismos modificados genéticamente, trabajar
con la tranquilidad de tener materia de estudio y experimentación suficiente. Para ello, se utilizan básicamente la
clonación del ADN y la PCR.
La clonación del ADN → Para modificar y/o transferir un gen de un
organismo donante a un organismo receptor, el primer paso es obtener
un número suficiente de copias de ese gen. Para conseguir todas estas
copias se puede realizar una clonación del ADN: el ADN se introduce en
una célula para que pueda ser copiado y mantenido.
Para poder introducir el fragmento de ADN en una célula, debemos
insertarlo en un vector de clonación, capaz de entrar y de replicarse de
forma independiente en una célula huésped. Así, el ADN recombinante
está compuesto por el gen que se desea clonar y el vector de clonación,
que actúa como medio de transporte.
Existen diversos vectores de clonación:
Para la expresión de genes en bacterias, los vectores más
utilizados son los plásmidos, que son pequeñas moléculas
circulares de ADN que pueden replicarse independientemente
en bacterias. Los plásmidos que contienen un fragmento de ADN
insertado se denominan plásmidos recombinantes.
En ocasiones, es más útil expresar un gen clonado en una célula
eucariota. Por ello, se utilizan generalmente como vectores de
expresión determinados virus que producen alto nivel de
expresión génica.
, La clonación se lleva a cabo en 6 etapas sucesivas:
- Preparación del ADN → El gen o fragmento de ADN que se quiere clonar debe ser aislado de la muestra
mediante las enzimas de restricción.
- Preparación del vector → Este puede ser, como se ha comentado, un plásmido, un virus, etc.
- Unión del ADN al vector → Se realiza gracias a una ligasa.
- Incorporación del ADN recombinante → El ADN recombinante se introduce en la célula huésped, en la cual va
a replicarse, aumentando el número de copias.
- Propagación celular y selección → Se seleccionan las bacterias que han incorporado el ADN recombinante y
se cultivan en un medio antibiótico, pues en el vector se incluyó el gen de resistencia a ese antibiótico.
- Expresión del gen clonado → El ADN recombinante se puede expresar, con lo que formará las proteínas que
se pretendían obtener desde un principio.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) → Otro método utilizado para conseguir un gran número de copias del gen
que necesitamos es la PDR. La PCR imita in vitro el ciclo de replicación del ADN, que tiene lugar en la célula antes de
dividirse, y lo repite unas 20-30 veces. Así, se obtiene un gran número de copias de cualquier secuencia de ADN.
Para realizar la PCR, se añaden en un tubo de ensayo:
- El ADN que se quiere amplificar.
- Los cebadores, complementarios a las secuencias de ADN que rodean el gen que queremos aislar.
- Los cuatro tipos de desoxirribonucleótidos trifosfatos necesarios para sintetizar el nuevo ADN.
- La ADN polimerasa, resistente al calor.
En cada ciclo de la PCR se suceden varias etapas:
- Etapa 1: Desnaturalización → Se calienta el contenido del tubo a 95ºC, para así separar las dos cadenas de
ADN que se va a clonar.
- Etapa 2: Hibridación → Se enfría a 55ºC para promover la hibridación de los cebadores con las secuencias que
limitan en ambas cadenas el gen que queremos amplificar.
- Etapa 3: Síntesis de ADN → Se vuelve a calentar el medio a 72ºC, para que la ADN polimerasa sintetice las
nuevas cadenas de ADN.
Finalizada la etapa 3, se vuelve de nuevo a la etapa 1, y así sucesivamente hasta realizarse entre 20 y 30 ciclos.
La PCR es una herramienta esencial para la detección de microorganismos patógenos en etapas muy tempranas de la
infección, así como para la obtención de la huella genética de ADN en la medicina forense, y los estudios de las
relaciones evolutivas entre especies.
La ingeniería genética es un conjunto de técnicas que permiten manipular y transferir los genes de un organismo a
otro. De este modo, se obtienen organismos genéticamente modificados.
Para transferir los genes de un organismo a otro, necesitaremos obtener la secuencia de ADN recombinante, obtener
cantidades suficientes de recombinante e introducir el ADN recombinante en un organismo vivo. Vamos a ver algunos
detalles de cada uno de estos tres procesos:
OBTENCIÓN DE LAS SECUENCIAS DE ADN RECOMBINANTE
Las herramientas básicas para la construcción de moléculas de ADN
recombinante (procedente de otros organismos) son las endonucleasas
de restricción y las ADN ligasas:
- Las endonucleasas de restricción son enzimas sintetizadas por
bacterias, que son capaces de cortar en fragmentos el ADN de
cualquier organismo.
- Las ADN ligasas unen los extremos cohesivos de los fragmentos
de ADN generados por las endonucleasas de restricción.
OBTENCIÓN DE CANTIDADES SUFICIENTES DE ADN RECOMBINANTE
Una vez obtenidos los fragmentos de ADN recombinante con el que se quiere trabajar, el siguiente paso será conseguir
un volumen de fragmentos que nos permita, a la hora de generar organismos modificados genéticamente, trabajar
con la tranquilidad de tener materia de estudio y experimentación suficiente. Para ello, se utilizan básicamente la
clonación del ADN y la PCR.
La clonación del ADN → Para modificar y/o transferir un gen de un
organismo donante a un organismo receptor, el primer paso es obtener
un número suficiente de copias de ese gen. Para conseguir todas estas
copias se puede realizar una clonación del ADN: el ADN se introduce en
una célula para que pueda ser copiado y mantenido.
Para poder introducir el fragmento de ADN en una célula, debemos
insertarlo en un vector de clonación, capaz de entrar y de replicarse de
forma independiente en una célula huésped. Así, el ADN recombinante
está compuesto por el gen que se desea clonar y el vector de clonación,
que actúa como medio de transporte.
Existen diversos vectores de clonación:
Para la expresión de genes en bacterias, los vectores más
utilizados son los plásmidos, que son pequeñas moléculas
circulares de ADN que pueden replicarse independientemente
en bacterias. Los plásmidos que contienen un fragmento de ADN
insertado se denominan plásmidos recombinantes.
En ocasiones, es más útil expresar un gen clonado en una célula
eucariota. Por ello, se utilizan generalmente como vectores de
expresión determinados virus que producen alto nivel de
expresión génica.
, La clonación se lleva a cabo en 6 etapas sucesivas:
- Preparación del ADN → El gen o fragmento de ADN que se quiere clonar debe ser aislado de la muestra
mediante las enzimas de restricción.
- Preparación del vector → Este puede ser, como se ha comentado, un plásmido, un virus, etc.
- Unión del ADN al vector → Se realiza gracias a una ligasa.
- Incorporación del ADN recombinante → El ADN recombinante se introduce en la célula huésped, en la cual va
a replicarse, aumentando el número de copias.
- Propagación celular y selección → Se seleccionan las bacterias que han incorporado el ADN recombinante y
se cultivan en un medio antibiótico, pues en el vector se incluyó el gen de resistencia a ese antibiótico.
- Expresión del gen clonado → El ADN recombinante se puede expresar, con lo que formará las proteínas que
se pretendían obtener desde un principio.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) → Otro método utilizado para conseguir un gran número de copias del gen
que necesitamos es la PDR. La PCR imita in vitro el ciclo de replicación del ADN, que tiene lugar en la célula antes de
dividirse, y lo repite unas 20-30 veces. Así, se obtiene un gran número de copias de cualquier secuencia de ADN.
Para realizar la PCR, se añaden en un tubo de ensayo:
- El ADN que se quiere amplificar.
- Los cebadores, complementarios a las secuencias de ADN que rodean el gen que queremos aislar.
- Los cuatro tipos de desoxirribonucleótidos trifosfatos necesarios para sintetizar el nuevo ADN.
- La ADN polimerasa, resistente al calor.
En cada ciclo de la PCR se suceden varias etapas:
- Etapa 1: Desnaturalización → Se calienta el contenido del tubo a 95ºC, para así separar las dos cadenas de
ADN que se va a clonar.
- Etapa 2: Hibridación → Se enfría a 55ºC para promover la hibridación de los cebadores con las secuencias que
limitan en ambas cadenas el gen que queremos amplificar.
- Etapa 3: Síntesis de ADN → Se vuelve a calentar el medio a 72ºC, para que la ADN polimerasa sintetice las
nuevas cadenas de ADN.
Finalizada la etapa 3, se vuelve de nuevo a la etapa 1, y así sucesivamente hasta realizarse entre 20 y 30 ciclos.
La PCR es una herramienta esencial para la detección de microorganismos patógenos en etapas muy tempranas de la
infección, así como para la obtención de la huella genética de ADN en la medicina forense, y los estudios de las
relaciones evolutivas entre especies.
