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Apuntes Anatomía Patológica y Citodiagnóstico
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Apuntes de biología molecular sobre secuenciación de ácidos nucleicos
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de ácidos nucleicosSecuenciación de los ácidos nucleicos
La secuenciación de los ácidos nucleicos es el procesos de determinación de la secuencia de nucleótidos que
componen una molécula de ADN o de ARN y que se representa por las iniciales de las bases nitrogenadas que
portan, esta se escribe en sentido 5’-3’.
Históricamente:
- 1980: Nobel a W. Gilbert y F. Sanger: inventores de las técnicas manuales basadas en reacciones químicas o
reacciones enzimáticas.
- 1983: Kari Mullis desarrolla la PCR.
-90s: electroforesis capilar (secuenciación automática de 1ª generación).
- 2000s: pirosecuenciación (secuenciación automática de 2ª generación).
-2010: Ion Torrent System Inc. (secuenciación gde 3ª generación).
Método químico de Maxam y Gilbert
El método de secuenciación de ADN de Maxam y Gilbert se basa en la
modificación de las bases nitrogenadas mediante reacciones químicas
específicas.
Permite secuenciar fragmentos corotos de ADN y requiere cantidades
elevadas de la molécula de ADN purificada.
Procedimiento:
Marcaje de uno de los extremos de la molécula con el isotopo
radiactivo P32: se elimina el primer fosfato en posición 5’ del
primer nucleótido mediante una fosfatasa alcalina y fosforilando
de nuevo mediante una kinasa y ATP marcado con P32.
Reacciones de modificación química de las bases
nitrogenadas: la muestra se divide en 4 alícuotas y en cada una
de ellas se lleva a cabo una reacción química distinta.
Tubo 1: modificación de G por dimetil sulfato (DMS)
Tubo 2: modificación de purinas (A y G) por ácido fórmico
Tubo 3: modificación de pirimidinas (C y T) con hidracina
Tubo 4: modificación de C con hidracina + sale (NaCl 2M)
Acabada la modificación de las bases, a los tubos se les añade
piperidina, que rompe la cadena a nivel de las bases modificadas.
En cada tubo obtenemos una mezcla de fragmentos, marcados y
sin marcar, de distintas longitudes.
Electroforesis de alta resolución (gel de poliacrilamida 10%-
20%): en condiciones desnaturalizantes, para separar por
tamaño los fragmentos presentes en cada tubo; cada producto de cada tubo en una calle (habrá 4 calles).
Autorradiografía del gel: proporciona una serie de bandas oscuras en cada una de las 4 calles del gel,
correspondientes a los fragmentos marcados obtenidos en cada tubo.
Análisis de autorradiografía: la lectura se inicia por el extremo inferior 5’. (Al escribirlo es muy
importante escribir la dirección, es decir, cual es el extremo 5’ y cual el 3’).
, Métodos enzimáticos de terminación de cadena
Los métodos de terminación de cadena son método enzimáticos basados en reacciones de polimerización de
cadenas complementarias a la que se quiere secuenciar.
A la mezcla de reacción se añaden didesoxinucleotidos trifosfato ddNTP, que son desoxinucleótidos que carecen
del grupo 3’-OH necesario para formar un nuevo enlace fosfodiéster. Cuando los ddNTP se incorporan a una
cadena de ADN en crecimiento actúan como terminadores de cadena y detienen la síntesis.
Secuencia fragmentos cortos de ADN monocatenario.
Procedimiento:
Reacciones de polimerización: la muestra se divide en 4 alícuotas, cada una para la reacción de
polimerización de cada base nitrogenada.
Cada tubo contiene un hebra molde de ADN (cadena que se quiere secuenciar), un cebador marcado en
su extremo 5’ con P32 y complementario del extremo 3’ de la hebra molde, ADN polimerasa, los 4 dNTP,
y uno de los 4 ddNTP posibles, que es el que marca la especificidad de cada reacción, en una concentración
mucho menor que los dNTP (200 veces menor).
La ADN polimerasa extiende el cebador marcado, sintetizando una cadena de ADN complementaria de la
hebra molde, hasta que, por azar, incorpora un ddNTP, lo que detiene la elongación de la cadena.
Electroforesis: las cadenas de nueva síntesis se separan de las hebras molde mediante desnaturalización
por calor y se someten a electroforesis de alta resolución en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizante, en estas condiciones, los fragmentos marcados se separan por tamaño con una
resolución de 1 solo nucleótidos.
Como en el método anterior, los productos de las 4 reacciones se hacen correr en paralelo en calles
adyacentes del mismo gel.
Autorradiografía del gel: obtención de un patrón de bandas oscuros correspondientes a los fragmentos
producidos en la polimerización.
Análisis de la autorradiografía: en cada calle, el ultimo nucleótido (en posición 3’) del fragmento que
representa cada banda es el ddNTP que se añadió en el tubo. En consecuencia, se puede determinar la
secuencia completa según el orden escalonado de las bandas en 4 calles, realizando la lectura de abajo
arriba de la autorradiografía (los fragmentos más cortos migran más rápido que los largos).
Hay que tener en cuanto que la secuencia que se lee directamente de la autorradiografía corresponde a
la cadena de nueva síntesis en dirección 5’ – 3’, por lo que la secuencia de la hebra molde será la
complementar e irá en sentido contrario a la leída.
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