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Apuntes Anatomía Patológica y Citodiagnóstico
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- Anatomía Patológica Y Citodiagnóstico
Apuntes de biología molecular sobre hibridación de ácidos nucleicos.
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1. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN SEGÚN EL MEDIOSe diferencian según el medio o soporte en el que se realizan.
Técnicas de hibridación en soporte sólido: se caracterizan porque una de las moléculas
implicadas (secuencia diana o sonda) se inmoviliza sobre un soporte sólido previo a la hibridación.
Lo habitual es fijar al soporte la muestra que contiene la secuencia diana e incubar
posteriormente con la sonda marcada para formar el híbrido; en esta metodología se basan las
técnicas Dot blot, Southern bot y Northern blot.
En otras ocasiones se obtiene más información fijando al soporte la sonda e incubando
posteriormente con el ácido nucleico que se estudia, previamente marcado; en esta metodología
se basan los Microarrays.
Técnicas de hibridación en soporte líquido: el híbrido sonda/secuencia diana se forma en
solución, normalmente en pocillos de una placa microtiter, y posteriormente, se fija a la pared
del pocillo para proceder a su detección. Una característica de estas técnicas es que
habitualmente no se marca ni a sonda ni al muestra; el híbrido se detecta por métodos indirectos
más o menos complejos.
Estas técnicas se han desarrollado fundamentalmente para diagnostico microbiológico y
especialmente para la detección de virus; permiten analizar múltiples muestras simultáneamente
y son fácilmente automatizables; las más importantes son la técnica de captura de híbrido y la
técnica de ADN ramificado.
Técnicas de hibridación in situ: permiten detectar y localizar secuencias de ác. nucleicos (ADN
y ARN) sobre cromosomas metafásicos, cél. y tejidos. Las técnicas de hibridación in situ son las
técnicas en las que la hibridación de los ác. nucleicos se realiza directamente sobre extensiones
citológicas o secciones de tejido y el resultado se analiza microscópicamente en el contexto de
detalles morfológicos.
Según el marcador empleado se diferencian 2 tipos:
-Hibridación in situ fluorescente (FISH): las sondas se marcan con fluorocromos, se requiere un
microscopio de fluorescencia para visualizar los resultados.
-Hibridación in situ cromogénica (CISH): las sondas se marcan con haptenos, los híbridos se
detectan por métodos inmunohistoquímicos, produciéndose al final una reacción coloreada que
se visualiza con un microscopio óptico normal.
2.DOT BLOT
El dot blot es una técnica de hibridación simple que usa membranas de nitrocelulosa o nailon
como soporte sólido y que permite detectar secuencias de ác. nucleidos, ADN o ARN, en una
mezcla compleja, sin aportar ninguna info. adicional (solo presencia/ausencia).
ES la técnica de hibridación más simple. Sobre las membranas de nitrocelulosa o nailon, se coloca
directamente una gota de la muestra que se va a analizar que puede ser un ácido nucleicos
purificado, un lisado celular, un producto de amplificación por PCR…
Esta técnica permite el estudio simultáneo de varias muestras aplicando cada muestras en una
zona distinta de la membrana y se pueden hacer cono sondas radiactivas o con sondas marcadas
con haptenos.
1
,2.1. PROTOCOLO DEL DOT BLOT
1.Aplicación de la muestra al soporte: antes de iniciar la aplicación de las muestras, hay que
humedecer la membrana que actúa de soporte sólido mediante inmersión durante 10 minutos en
un tampón adecuado o agua destilada, según el tipo de membrana y la recomendación del
fabricante (por ejemplo, para membranas de nitrocelulosa se utiliza tampón SSC 6x).
Transcurrido este tiempo, se saca del líquido humectante y se retira
el exceso de este colocando la membrana entre dos hojas de papel
de filtro.
Una vez humedecida la membrana, se ensambla en un sistema de
vacío que es el que va a permitir que se consiga una adecuada fijación
de la muestra a la membrana.
El sistema de vacío consta de una plantilla con pocillos numerados
para realizar y poder localizar las aplicaciones, debajo de la cual se
sitúa la membrana de nitrocelulosa o nailon humedecida y una junta
selladora para evitar la contaminación cruzada entre muestras, este
conjunto se sitúa sobre una cámara colectora que va conectada a
vacío. La membrana debe permanecer siempre húmeda (bolsas
termosellables, herméticas, cubetas, frascos…). El proceso de
aplicación de la muestra varía para ADN y ARN.
-Aplicación de muestras de ADN:
Las muestras de ADN deben ser desnaturaliza das antes de su aplicación a la membrana:
las muestras se incuban con hidróxido sódico (NaOH) a una concentración final 0,4 M y
EDTA a una concentración final 10 mM, a 100ºC durante 10 minutos.
A continuación, se neutralizan las muestras con un volumen igual de acetato de amonio
2M a pH 7,0.
Montar el soporte de Dot blot.
Cargar las muestras en las posiciones correspondientes de la plantilla.
Aplicar vacío, de manera que el ADN queda retenido en la membrana por el esqueleto
azúcar – PO4 (azúcar-fosfato), quedando las bases nitrogenadas hacia el exterior para
hibridar con sonda (los reactivos se filtran a cámara colectora).
Lavar cada muestra con NaOH 0,4M (o SSC 2x) y filtrar por vacío.
Terminado este proceso, se desmonta el sistema de vacío, se lava la membrana con SSC
2x y se seca en estufa a 80 0C durante 30-120 minutos para unir permanentemente el
ADN a la membrana. Alternativamente, las muestras dispuestas sobre membranas de
nailon pueden ser ancladas definitivamente a estas mediante irradiación con luz
ultravioleta.
-Aplicación de muestras de ARN:
Para evitar la formación de horquillas intracatenarias que dificultarían la hibridación,
conviene desnaturalizar las muestras de ARN incubando con NaOH 10mM + EDTA 1mM
a 100ºC por 10 minutos.
Neutralizar las muestras con un volumen igual de acetato de amonio 2M pH=7.
Montar el soporte Dot blot.
Cargar las muestras en las posiciones correspondientes de la plantilla.
Aplicar el vacío, de manera que el ARN quede retenido en la membrana.
Lavar cada muestra con NaOH 0,4M (o SSC 2x) y filtrar por vacío.
Apagar la bomba de vacío y desmontar el sistema de vacío.
Lavar la membrana colocándola en un recipiente con SSC 2x, 0,1% SDS
Secar en la estufa a 80ºC la membrana de nitrocelulosa, entre 30 – 120 minutos para
que el ARN quede perfectamente unido a la membrana. Las muestras sobre membranas
de nailon pueden ser ancladas definitivamente mediante irradiación con luz UV.
2.Prehibridación: las membranas con las muestras se incuban con una solución de
prehibridación para bloquear las posibles uniones inespecíficas de la sonda a la membrana, de
2
, manera que al añadir esta solo se pueda unir de manera específica a la secuencia diana; este es
un paso fundamental para minimizar el ruido de fondo. Las soluciones de prehibridación suelen
tener la misma composición que las soluciones de hibridación, pero sin sonda. Pueden llevar un
ADN Carrier, normalmente ADN de esperma de salmón o solución Denhardt, que van a bloquear
las uniones inespecíficas de ácidos nucleicos a las membranas.
La membrana se incuba con la solución de prehibridación a la misma Tª a la que se hará la
hibridación, es decir, a 65-68ºC si no se usa formamida (ADN) o a 42ºC si se usa formamida
(ARN); el tiempo de incubación varía mucho según los protocolos, desde minutos hasta horas.
3.Hibridación: las sondas de ADN bicatenario se desnaturalizan inmediatamente antes de su
uso mediante calentamiento a 95-100ºC por 5 minutos y enfriamiento rápido en hielo.
Para hacer la hibridación, se retira la solución de prehibridación del contenedor en el que se está
realizando la técnica y se sustituye por un volumen igual de solución fresca a la que se le añade
la sonda recién desnaturalizada. La membrana se incuba con esta solución a la Tª adecuada, en
agitación, durante 4-24 horas (según el protocolo).
4.Lavado de posthibridación: se elimina la solución de hibridación haciendo lavados
añadiendo soluciones de SSC en concentraciones decrecientes (SSC2x, SSC0,5x, SSC0,1x), al
disminuir la fuerza iónica de la solución se aumentan las condiciones de rigurosidad (también si
aumenta la Tª de lavado).
5.Detección del híbrido:
-Marcaje radiactivo: si la sonda empleada está marcada radiactivamente, finalizado el último
lavado de posthibridación la membrana se puede secar y se revela mediante exposición
autorradiográfica, colocando una placa radiográfica encima y manteniendo el conjunto en
oscuridad durante horas-días. Al revelar la placa, aparecerán puntos negros en las posiciones
correspondientes a las muestras positivas, es decir, aquellas que contenían la secuencia diana.
En caso de que la membrana con las muestras se vaya a usar para realizar una segunda
hibridación (rehibridación) es importante que esta no se deje seca, en este caso, la membrana
se envuelve en plástico para mantenerla húmeda y evitar el contacto con la placa fotográfica.
-Marcaje con haptenos: si la sonda empleada esté marcada con haptenos, a continuación de los
lavados se revela con un método de detección cromogénico, cuyo resultado es una mancha
coloreada en las posiciones correspondientes a las muestras positivas; cuando las membranas se
han sometido a una detección cromogénica no pueden usarse para una segunda hibridación,
puesto que los compuestos coloreados que se generan son insolubles, precipitan y tiñen la
membrana de manera indeleble.
6.Rehibridación (solo si sonda con marcaje radiactivo): para ello hay que desnaturalizar los
híbridos formados y eliminar la primera sonda utilizada. Es fundamental que la membrana
permanezca siempre húmeda y que no se seque durante la autorradiografía. Para despegar la
primera sonda, la membrana se somete a dos lavados de 20 minutos cada uno con una solución
de baja fuerza iónica (SSC 0,1x) con detergente (SDS 0,5%) en agitación y a una Tª de 95ºC;
para comprobar que el lavado ha sido efectivo se expone una nueva placa radiográfica toda la
noche, se revela y se comprueba que la placa está limpia. A continuación, se inicia nuevamente
el protocolo de hibridación a partir de la prehibridación.
2.2. APLICACIONES DEL DOT BLOT
Técnica de rastreo (screening): para detectar secuencias de interés en múltiples muestras
simultáneamente. Ejemplos:
Estudios de expresión génica, para detectar ARNm concretos en poblaciones celulares
en situación basal y tras distintas estimulaciones, en cél. tumorales…
Detección de secuencias extrañas en muestras biológicas, por ejemplo, para detectar
la presencia de virus, bacterias, parásitos
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