Escuela superior politécnica del litoral Fc
v
Facultad de ciencias de la vida
Biología Celular y Molecular
LABORATORIO PRÁCTICO
Facultad de
ciencias de la
vida
CÓDIGO
NOMBRE Analía Paulina Rodríguez Díaz BIOG1021
PROFESOR Eduardo Sánchez Timm
LABORATORIO Microbiología y técnicas moleculares
FECHA 12/Enero/2023 PARALELO 104
TEMA DE LA PRÁCTICA 5 Cortes con enzimas de restricción
OBJETIVOS:
Objetivo General:
Realizar cortes con enzimas de restricción en muestras de ADN genómico para la observación de
varios fragmentos y la diferenciación de los resultados entre las muestras.
Objetivos Específicos:
-Interpretar los fragmentos de ADN observados luego de los cortes con enzimas de restricción
mediante el uso del transiluminador y la electroforesis con gel de agarosa.
-Explicar la acción del Hind III en muestras como ADN genómico para la comprensión de los
resultados obtenidos en la práctica de laboratorio.
INTRODUCCION:
Existen enzimas que cambian la estructura de los ácidos nucleicos, como las nucleasas, estas tienen
la capacidad de cortar los enlaces fosfodiéster que mantienen unidos a los nucleótidos. Las
nucleasas pueden dividirse en endonucleasas, si cortan el enlace fosfodiéster en nucleótidos
ubicados dentro de la cadena del ácido nucleico y, exonucleasas, si realizan su acción en los
, Escuela superior politécnica del litoral Fc
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Biología Celular y Molecular
LABORATORIO PRÁCTICO
Facultad de
ciencias de la
vida
extremos de las cadenas. Las enzimas de restricción corresponden a enzimas endonucleasas, tienen
origen bacteriano y como otra característica importante es que cortan en una secuencia especifica
llamada secuencia diana.
Una vez realizados los cortes por parte de las enzimas de restricción, estos pueden ser de estructuras
cohesivas o romas. Para la primera, la enzima corta en cada cadena de ADN entre nucleótidos en
posiciones distintas produciendo extremos monocatenarios. Siendo así que, mediante
complementariedad las partes que faltan de una cadena interactúan con otro fragmento en mono
cadena, esto origina condiciones ideales de unión para la producción de ADN recombinante. Por
otro lado, los cortes romos son generados debido a que la enzima interviene en ambas cadenas de
ADN sobre un mismo eje y la unión entre estas porciones de ADN no responden a una
complementariedad (González & Bueno, 2013).
Para la práctica de laboratorio se utilizó la enzima de restricción Hind III, proveniente del
microorganismo Haemophilus influenzae, que contiene una diana de restricción en el ácido
desoxirribonucleico de cadena doble que depende de una secuencia metilada, asimétrica y
palindrómica donde realiza su actividad generando extremos cohesivos. El sitio de reconocimiento
o secuencia corresponde a AAGCTT (Quimica.es, s.f). Además, se requirió de un BSA, que es una
seroalbúmina bovina que tiene como función estabilizar las enzimas, a la vez que aumenta el
rendimiento de la reacción en cadena de polimerasa (Thermo Fisher Scientific, s.f).
MATERIALES Y EQUIPOS:
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CÓDIGO
NOMBRE Analía Paulina Rodríguez Díaz BIOG1021
PROFESOR Eduardo Sánchez Timm
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TEMA DE LA PRÁCTICA 5 Cortes con enzimas de restricción
OBJETIVOS:
Objetivo General:
Realizar cortes con enzimas de restricción en muestras de ADN genómico para la observación de
varios fragmentos y la diferenciación de los resultados entre las muestras.
Objetivos Específicos:
-Interpretar los fragmentos de ADN observados luego de los cortes con enzimas de restricción
mediante el uso del transiluminador y la electroforesis con gel de agarosa.
-Explicar la acción del Hind III en muestras como ADN genómico para la comprensión de los
resultados obtenidos en la práctica de laboratorio.
INTRODUCCION:
Existen enzimas que cambian la estructura de los ácidos nucleicos, como las nucleasas, estas tienen
la capacidad de cortar los enlaces fosfodiéster que mantienen unidos a los nucleótidos. Las
nucleasas pueden dividirse en endonucleasas, si cortan el enlace fosfodiéster en nucleótidos
ubicados dentro de la cadena del ácido nucleico y, exonucleasas, si realizan su acción en los
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extremos de las cadenas. Las enzimas de restricción corresponden a enzimas endonucleasas, tienen
origen bacteriano y como otra característica importante es que cortan en una secuencia especifica
llamada secuencia diana.
Una vez realizados los cortes por parte de las enzimas de restricción, estos pueden ser de estructuras
cohesivas o romas. Para la primera, la enzima corta en cada cadena de ADN entre nucleótidos en
posiciones distintas produciendo extremos monocatenarios. Siendo así que, mediante
complementariedad las partes que faltan de una cadena interactúan con otro fragmento en mono
cadena, esto origina condiciones ideales de unión para la producción de ADN recombinante. Por
otro lado, los cortes romos son generados debido a que la enzima interviene en ambas cadenas de
ADN sobre un mismo eje y la unión entre estas porciones de ADN no responden a una
complementariedad (González & Bueno, 2013).
Para la práctica de laboratorio se utilizó la enzima de restricción Hind III, proveniente del
microorganismo Haemophilus influenzae, que contiene una diana de restricción en el ácido
desoxirribonucleico de cadena doble que depende de una secuencia metilada, asimétrica y
palindrómica donde realiza su actividad generando extremos cohesivos. El sitio de reconocimiento
o secuencia corresponde a AAGCTT (Quimica.es, s.f). Además, se requirió de un BSA, que es una
seroalbúmina bovina que tiene como función estabilizar las enzimas, a la vez que aumenta el
rendimiento de la reacción en cadena de polimerasa (Thermo Fisher Scientific, s.f).
MATERIALES Y EQUIPOS:
