Identificatie & structuur van biomoleculen 1/5 Patrick D’haese
11/03/2019
Hoofdstuk 1: analytische performantie, kwaliteitscontrole en kalibratie
Over elk hoofdstuk meestal een vraag met telkens een aantal subvragen waardoor je toch nog
punten kan halen met de kennis van enkele subvragen
Welke parameters bepalen de performantie van je analytische techniek?
-> eigen methode evalueren en dan uiteindelijk valideren = kwaliteitscontrole
*verhaaltje ratten?*24:00 -> is er een fout geslopen in onze analyse dmv een outlier?
-> resultaat 20x hoger dan de rest, wat moeten we nu met deze outlier doen; is dat wel zo
of is er gewoon een fout ingeslopen?
-> je kan je staal dan opnieuw meten of het laten vallen; allemaal beslissingen die je moet
nemen
Biochemische analyse: 2 soorten
1. kwalitatieve analyse
-> gaat zich niet bezig houden met bepaling van concentratie van je compound in
bepaalde matrix in vloeistof
-> eerder welke component van een stof aanwezig is, wat er aanwezig is
2. kwantitatieve analyse
-> inwinnen informatie betreffende relatieve hoeveelheid, zijnde de concentratie van ofwel:
- hoeveelheid van één compound of meerdere -> je kan dus ook partiële analyse
doen
- bv. bij legering bepaling -> wat zit er allemaal in? Allemaal samen geeft 100% van
bv. verschillende soorten metalen -> hoeveel % edele metalen in zitten; welke en
hoeveel?
- soms totaal analyse van eiwit ipv component bv. albumine component in bloed?
-> je bent dus niet geïnteresseerd in één molecule maar in een groep van
aanverwante moleculen bv. totaal eiwitgehalte in serum
Je kan dit analyseren via volume, gewicht, stroomsterkte, massa (massa/ladingsverhouding in
MS,…) -> zo weten wat componenten zijn en concentratie kunnen bepalen
Wat zou performantie van analyse bepalen?
bv. glucose in bloed bepalen, je wil enkel glucose meten en niets anders
-> analyse gaat dus enkel op voor de component die je wil bepalen = specificiteit
-> 100% is ideaal en dat wil je dan ook nastreven
Soms ook methode die niet specifiek genoeg is, en proberen te verbeteren tot idealiter 100%
en je kan meten voor één bepaalde component
Kan ook partieel analyse doen waarbij je specifieke groep van eiwitten target = selectiviteit
-> bv. voor groep van aanverwante moleculen
Sensitiviteit = gevoeligheid >< detectielimiet
-> is sensitiviteit gelijk aan de laagste concentratie die je kan meten? Neen, dat is je
detectielimiet
-> sensitiviteit moet zo hoog mogelijk zijn, detectielimiet zo laag mogelijk
Dit zijn er dus al 4 van de 7 die de belangrijkste zijn
Variatiecoëfficiënt = precisie (eigenlijk zelfde als herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid)
Staal en je hebt het 10x verdund en je gaat het nu 10x achter elkaar meten en de resultaten
vergelijken en je verwacht dus dat de concentratie van die stalen allemaal hetzelfde zijn, dan heb
je een goede methode
-> heb je 92, 79, 112,… dan is dat niet zo goed
= intra- within variatiecoëfficiënt
Als je nu zelfde staal nu eens dan meet, dan week later, maand later, jaar later,…
-> telkens opnieuw toestel standaardiseren, opnieuw kalibreren,… zijn allemaal mogelijkheden tot
fouten!
= inter- between run variatiecoëfficiënt
,Identificatie & structuur van biomoleculen 2/5 Patrick D’haese
11/03/2019
Accuraatheid = je doet analyse; hoe is mijn uitkomst, hoe benadert die de theoretische exacte
waarde
Hoe sterk benadert theoretische analyse, de exacte waarde = accuraatheid
-> kan je gebruiken tov referentiestalen, kan je kopen, analyseert het volgens ontwikkelde
methode, concentratie bepalen en kijken hoeveel wijkt die af van theoretische waarde
-> 75 ipv 100microgram/L uitkomen is niet accuraat; uitwijking mag maximaal 5% zijn
-> dus resultaat moet tussen 95 en 105 liggen = accurate methode
-> sommige analyses moeten nog veel nauwkeuriger zijn omdat bv. bepaalde zouten,
ionen in bloed liggen tussen veel nauwere fysiologische grenzen
Variatiecoëfficiënt = reproduceerbaarheid, herhaalbaarheid of precisie
Laatste parameter die belangrijk is: staal verdunnen in water, buffer bij doen, pH regelen,…
-> bepaalde verbindingen kunnen dus ook in je reagentia zitten om je staal voor te
bereiden en maak je dus een fout
-> zal je moeten corrigeren!
Blanco signaal is bv. iets waarmee je je standaard verdunt om verschillende concentraties te
bekomen -> daar kan je voor gaan corrigeren bv. verbinding meten in serum en daar doe je ook
nog andere zaken bij bv. buffer, reagentia,…
-> ipv serum neem je nu gedestilleerd water samen met al die buffers, reagentia,…
waardoor je dus in principe normaal geen signaal zou krijgen, nu ook een signaal krijgt
-> daarvoor kan je dan gaan corrigeren omdat je toevoeging aan je water ook hetzelfde is
aan de toevoegingen van je onbekend staal
Telkens proberen de 100% specificiteit te benaderen in biomedische laboratoria
Stel dat je bepaalde molecule wenst te bepalen maar andere molecules gaan mee reageren, kan
je op zoek gaan naar stof bv. chelator (in metalen) die heel specifiek met bepaald element gaat
reageren
-> kleurreactie dus enkel te wijten aan stof die je wenst te bepalen met andere molecules die nu
niet meer gaan mee reageren
Hoe gevoeligheid bepalen?
bv. 2 specifieke methodes en je moet de gevoeligste hebben
Signaal-concentratie grafiek -> voor alle 2 methodes een standaardcurve opstellen
-> uit stockoplossing een verdunningsreeks opstellen van dat wat je wenst te bepalen
-> je vindt telkens een bepaald signaal en je vindt curve met bepaalde helling dus die
helling wordt bepaald door je signaal-concentratie
Met welke methode met bepaalde concentratie krijg je nu het beste signaal, methode 1 of 2?
(tekening) -> signaal-concentratie verhouding methode 1 is het hoogst, dus meest gevoelig
Als gevoeligheid heel belangrijk is, opteren voor methode 1; telkens afweging maken wat voor jou
op die moment het belangrijkst is en alle factoren in rekening gebracht: kostprijs, welk toestel
nodig,…
Bij SM analyses ipv signaal-concentratie verhouding ook soms gebruik van karakteristieke massa
en sensitiviteit bepalen ahv deze karakteristieke massa = hoeveelheid van te doseren bestanddeel
die absorptie van licht veroorzaakt van 1%
-> lichtstraal doorsturen met bepaalde golflengte, 1% ervan wordt geabsorbeerd; die
minimale stof die men nodig heeft om 1% te absorberen = karakteristieke massa
-> hoe minder van stof nodig heeft om 1% van licht te absorberen, hoe gevoeliger
-> 1% absorptie komt overeen met 0.0044 absorbantie eenheden
Is die methode nu wel goed en gevoelig genoeg? bv. toestel gekocht en je gaat bepaalde
verbindingen meten en soms moet je heel lage concentraties meten en zie je dus dat je
gevoeligheid eigenlijk niet zo goed is; is je gevoeligheid wel voldoende voor wat je zou
verwachten van dat toestel?
-> voor bepaalde molecules verwacht je nl. bepaalde gevoeligheid voor molecules
,Identificatie & structuur van biomoleculen 3/5 Patrick D’haese
11/03/2019
-> als die gevoeligheid nu heel hard afwijkt van vooropgestelde gevoeligheid van toestel
voor bepaalde molecules dan zal er waarschijnlijk iets mis zijn
bv. te weinig licht door meetcel, detector die niet goed werkt
Altijd interessant om te weten of je goed bezig bent of niet; is methode goed of moet ze nog een
beetje bijgewerkt worden?
Kwantificatielimiet is iets stricter dan detectielimiet
Detectielimiet = minimale concentratie van de te bepalen stof die in staat is signaal te
veroorzaken die dubbele is van achtergrondsignaal
Ruis toestel = signaal van je toestel -> DL maar als je signaal/ruis van 2 hebt
bv. ruis signaal -> als je niets meet, heb je toch een signaal = ruis
als je dan staal hebt waar heel veel in zit, is dat geen probleem dan kan je het er gewoon
aftrekken maar als je signaal hebt die maar net boven ruis zit, dan weet je niet zeker of er
iets in je staal zit.
-> weet je alleen maar als signaal van onbekend staal het dubbele is van je ruis
-> S/R verhouding is dan 2
Signaal van onbekend staal moet dus minstens het dubbele zijn van je ruis om zeker te zijn dat er
iets in zit; je kan wel nog altijd niet zeggen hoeveel maar je weet dat er iets in zit
-> voor DL kan je ook formule 3xSD gebruiken
Om te weten zoveel zit erin moet je SD van ruis bepalen, vermenigvuldigd met 10
DL ≠ gevoeligheid
s9
Op methode A zit meeste ruis, dus S/N ratio -> om daar aan 2 te geraken ga je dus hoog signaal
moeten hebben
=> DL van methode B is beter dan die van A
- methode A is S/N ratio gelijk aan 2 (ruw geschat) -> DL niet zo hoog
Signaal-ruis verhouding van B is veel beter dan DL van A, hebt bijna geen ruis
Welke methode heeft beste gevoeligheid? (tekening)
Gevoeligheid van beide methodes is eigenlijk gelijk terwijl DL verschillend is, daarom mag je DL
niet verwarren met gevoeligheid!
Accuraatheid = maat voor afwijking van ons experimenteel gemeten resultaat tov onze
onbekende theoretische waarden
-> we kennen ze niet maar we kunnen ze wel kennen door gebruik te maken van
standaard monster van referentiemateriaal met gekende concentratie en het
hoogst analytische resultaat, die theoretische waarden gaan vergelijken
-> in principe die accuraatheid minder dan 5% afwijkt van theoretische waarde
Er bestaan heel veel standaardmonsters, referentiesignalen maar niet vanalles
bv. methode op punt en je wil erover schrijven, gaat reviewer vragen wat is je accuraatheid
van je methode -> reviewer zal dan niet content zijn
Hoe nu accuraatheid bepalen, want er zijn andere manieren?
Je kan zelf standaardoplossing maken bv. lantaan bepalen in hart (oraal innemen), daar bestaat
geen referentiesignaal van
-> je moet staal nauwkeurig afwegen, vaste stof dus je moet ’t eerst kapot maken bv. met
zuur
-> hartstaal wordt opgelost, lantaan zit er nog in -> wens je te bepalen en weten ben je
juist of niet?
-> destructievloeistof kan je zo gaan verdelen, gelijke volumes afnemen
-> standaardoplossing maken (kan je wel kopen) om y-curves opstellen en dus
verdunningsreeks aan te maken met gekende hoeveelheid toegevoegd
, Identificatie & structuur van biomoleculen 4/5 Patrick D’haese
11/03/2019
bv. 100microg/L destructievloeistof tot 1mL aanlengen met water, dan ook andere
met 100microg/L aanlengen tot 1mL met een oplossing met gekende
hoeveelheid lantaan die je gekocht hebt of zelf gemaakt
-> bij het ene met water krijg je zone piek en bij lantaan zone piek en het verschil is dan
hetgene dat je hebt toegevoegd
-> door toevoeging van een hoeveelheid van een onbekend staal bv. aangelengd met
water en hetzelfde onbekende staal aangelengd tot hetzelfde volume met standaard-
oplossing met gekende concentratie -> verschil in pieken tussen basaal signaal en het
geaddeerd? signaal meet, als die pieken gelijk zijn dan heb je een heel goeie accurate
methode = 100%
-> stel dat je voor standaard signaal van 50 meet en hetgeen je toegevoegd hebt
bijkomende op uw onbekend staal is maar 30 voor dezelfde concentratie dan heb je
maar een accuraatheid van 30 tov 50 = 60%
Allemaal abstract allemaal, zou je eigenlijk in het labo zelf ne keer moeten doen
-> als je recovery 100% is, is je accuraatheid ook 100%
Wanneer je zelfde staal op verschillende tijdstippen meet, moet je altijd zelfde uitkomst uitkomen
-> zo heb je heel goede precisie
- Accuraat maar niet precies stel theoretische waarde is 100 en je meet bv. ne keer 135, 85, 105,
… meten -> gemiddeld kom je dan rond de 100 uit maar hier heb je dan geen goede precisie
- Precies maar niet accuraat bv. verschillende waarden veel dichter tegen elkaar gelegen dus
ne keer 120, 117, 119, 118,… -> gemiddeld 120?
-> theoretische waarde = 100 -> accuraatheid van 80%
- Accuraat én precies
Om aan eigen kwaliteitscontrole te doen:
accuraatheid en precisie belangrijk te meten voor verschillende concentraties -> als je nu gaat
meten in lagere concentratie range dat onderliggende afwijkingen van uw signaal van een staal
dat die even hoog zijn
bv. gemeten staal met lage concentratie en je meet dat ne keer of 7-8, geen goede
methode en zeker niet voor de lagere concentraties
ook een staal met hogere concentratie en je meet dat ook paar keer enz.
-> onderliggende afwijking bij hoge concentraties zijn die even hoog als bij je lage
concentraties
-> variatie coëfficiënt bereken je dan door SD te delen door gemiddelde waarde
VC gaat bij lagere concentratie gaat veel hoger zijn dan VC zou zijn bij staal meten met heel
hoge concentratie
s14
links misschien VC 30% en rechts VC van 3%
-> dus bij rapportatie ben je dus verkeerd bezig -> VC of precisie dus altijd meten voor
verschillende concentraties = belangrijk!
-> SD voor lage concentraties is even hoog als de SD voor de heel hoge concentraties
-> VC die bepaald wordt door SD en gemiddelde waarde, in geval van lage concentratie
veel hoger zal zijn dan bij hoge concentratie en dat is dus niet goed want bij goede
methode is VC voor alle concentraties gelijk
Er bestaan ook methodes waarbij de VC voor de heel lage concentraties nog altijd niet goed is
(veel te hoog) maar vanaf bepaalde concentraties dat ie wel stabiel en relatief laag blijft
Ideale geval is: SD die iets hoger mag zijn bij hoge concentraties maar vooral heel laag is bij lage
concentraties -> als je nu SD hebt die heel laag is bij lage concentraties en iets hoger bij hoge
concentraties, dan krijg je VC die over ganse range constant en dus laag genoeg blijft
Op examen: waar moet je op letten als je VC wil hebben die over gans de concentratie range laag
is?
Je wil VC die constant is voor zowel de lage als de hoge concentraties maar als je toch moet
toegeven dan liefst een met een constante SD bij de lage concentraties die mag stijgen bij de
