Resume
Samenvatting Moleculaire Genetica Diagnostiek
- Cours
- Moleculaire Genetica
- Établissement
- Artesis Plantijn Hogeschool Antwerpen (Artesis)
Samenvatting + notities van tijdens de les
[Montrer plus]
Aperçu du contenu
1 Analysemethoden voor nucleïnezuren1.1 Inleiding
- Menselijk Genoomproject: 1990 – 2003 (> 10 jaar om genoom te sequensen)
- Vorderingen erfelijkheidsonderzoek:
▪ Eenvoudige stamboomanalyses → minuscule structuurveranderingen in chromosomen zicht-
baar maken
▪ Voor veel ziekten: verantwoordelijke gen en welke fout in gen
- Nieuwe behandelingen:
▪ Productie recombinante eiwitten (= eiwit dat men aangemaakt heeft door de code van het EW
in te brengen in m.o. of zoogdiercellen) voor therapie
▪ Gen- en stamceltherapie
- Diagnosetechnieken:
▪ Cytogenetische onderzoeksmethoden → uitzicht chomosomen
▪ Moleculaire onderzoeksmethoden → structuur aparte DNA-moleculen
1.1.1 Cytogenetische onderzoeksmethoden
1.1.1.1 Karyotypering
- Vertrek uit perifere bloedmonocyten (PBMC)
- Ook soms uit beenmerg, gekweekte huidfibroblasten, cellen van vruchtwater of chorion (één van
de membranen tussen foetus en moeder) villi
- Toevoegen fytohemagglutinine → stimulatie T-lymfocyten → mitose
- Na 48 – 72 uur: toevoeging colchicine (interfereert met de vorming van spoeldraden)→ stopt
celdeling in de metafase (chromos. net zichtbaar)
- Toevoegen hypotone oplossing → water opnemen → opzwellen → individuele chromos. scheiden
- Fixeren
- Op microscoopglaasje + drogen
1.1.1.2 G-banding
Gebruik van Giemsa-kleuring → G-banding: alternerende lichte en donkere bandjes, karakteristiek
voor ieder chromosomenpaar:
- Donkere bandjes: weinig genen, zijn
AT-rijk en repliceren laat in S-fase
- Lichte bandjes: 80% actieve genen
(huishoud-genen), GC-rijk en repliceren
vroeg in S-fase
- Precieze identificatie elk chromosoom
en ontbreken of bijkomen DNA-
materiaal tot 4000 kb
- Betere resolutie = FISH (fluorescence in situ hybridization), FCM of analyse DNA met aCGH (array
comparative genomic hybridision)
Alternatief: Quinacrine-kleuring → Q-banding
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 1
,1.1.1.3 Flow karyotypering
- Modernere techniek met betere resolutie
- Gebruikt om variatie in chromos. na te gaan en identificatie chromosoomafwijkingen
- Resolutie = 1 – 2 Mb t.o.v. 4 Mb voor lichtmicroscopische karyotypering
Resultaat:
- Flow karyotypes man en vrouw, elke piek =
individueel chromosomenpaar van groepen
chromosomen
- DNA-inhoud individuele chromosomen meten
m.b.v. FCM → vloeistofstroom door laser
- Chromosoomsuspensie kleuren: ethidium
bromide = fluorescerende kleurstof
- Meting: fotomultiplier
- Analyse: m.b.v. computer
- Resultaat:
▪ Histogram/ flow karyotype → chromos.
groeperen volgens stijgende DNA-inhoud
▪ Relatieve DNA-inhoud = gem. piek
▪ Relatief # chromos. in elke groep =
oppervlak onder piek (normaal 2)
▪ X-chromos. bij vrouw 2x groter dan bij man
1.1.2 Moleculaire onderzoeksmethoden
= bestuderen nucleïnezuren
Hoe?
- DNA- en RNA-isolatie
- DNA-detectie:
▪ Elektroforese
▪ Hybridisatie
• DNA probes
• Detectie van labels
• Stappen in het hybridisatieproces
• Hybridisatiemethoden
- DNA profielen
- Array-based Comparative Genome Hybridisation (aCGH)
- PCR en afgeleide technieken
- DNA sequentiebepaling: de ultieme diagnostische tool → 3FBT
1.2 DNA- en RNA-isolatie
- mRNA’s isoleren: poly(A)-staart aan 3’ eind
- Isolatie via poly(T)oligonucleotide te koppelen op magnetische beads
- Rnase vrij werken (bakken glasmateriaal, handschoenen dragen) en gebruik Rnase-remmers
- DNA: denaturatie en extractie
- Detectie:
▪ UV-absorptie DNA en RNA bij 260 nm
▪ UV-absorptie eiwitten bij 280 nm
▪ OD-ratio? 260 nm/ 280 nm → zuiverheid staal (DNA isoleren uit bloedstaal met EW)
▪ Intercalerende kleurstoffen (nestelen zich tussen baseparen): fluorescerende DNA en RNA
kleurstoffen → EtBr of SYBR Green
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 2
,1.2.1 DNA isolatie
- Via denaturatie en extractie
- Gebruik van zouten om eiwitten te denatureren en hoogmoleculaire NZ in oplossing
te houden
- Isoleren: absorptie op silicadeeltjes (kolommen) of filtratie over semi-permeabele
membraan waaraan DNA blijft plakken = DNA-vlok
1.2.2 mRNA isolatie
→ magnetische bolletjes met een T-staart
→ mRNA kan binden door hun A-staart
1.3 DNA-detectie
1.3.1 Gel-elektroforese
- Gebruik van agarose matrices (of polyacrylamide)
- DNA- en RNA moleculen d.m.v. hoog oplossend
vermogen scheiden
- Door negatief geladen fosfaatgroepen → nucleïne-
zuren bewegen zich bij pH 7 à 8 naar + pool
- Migratiesnelheid is afhankelijk van: type gelmatrix,
poriëngrootte, moleculaire afmetingen NZ en
conformatie NZ
Procedure:
Houder afplakken → “kammetje” plaatsen met slotjes → DNA staal laden → agarose in buffer brengen
→ opwarmen in microgolfoven → afkoelen tot 55°C → uitgieten → agarose gaat stollen = geleren →
einde elektroforese → op UV-transeleminator bekijken (tegenwoordig in geïntegreerd systeem)
1.3.1.1 Intercalerende stoffen
Ethidiumbromide
- Licht op bij UV licht
- Uiterst mutageen → vermijden → nu gebruik SYBR Safe!
- Werking: kruipt tussen baseparen → gebruik UV licht → DNA moleculen zichtbaar
SYBR Green = SYBR Safe
- Excitatie: max = 497 nm
- Emissie: max = 520 nm → licht uitzenden
- Minder mutageen dan EtBr, maar cytotoxisch → penetreert cellen
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 3
, 1.3.1.2 DNA gelelektoforese
Negatieve pool
Groot
Klein
Positieve pool
Legende:
- Links = lengtemerken van DNA-fragmenten met gekende grootte
- Midden = DNA geknipt mey drie verschillende restrictie enzymen
- Rechts = controle DNA, niet geknipt
1.3.1.3 RNA gelelektroforese
Negatieve pool
Positieve pool
Moeilijker, uit één celtype al het mRNA of totaal RNA isoleren → alle fragmenten verschillende lengte
→ nooit genoeg RNA-moleculen van zelfde lengte om zichtbaar te zijn op gel (bepaalde detectielimiet)
Wat is wel te zien:
- 28S rRNA (intenisteit 2x zo groot als de intensiteit van 18S rRNA)
- 18S rRNA
Legende:
- Laan 1 en 2: intacte RNA-stalen met 28S:18S rRNA ratio = 2:1
- Laan 3: gedegradeerd RNA met RNA smeer onder 28S en 18S rRNA bandjes
- Laan 4: gedegradeerd RNA → verlies 28S rRNA band en opstapeling gedegradeerd RNA onderaan
- Laan 5: RNA met aanzienlijke genomische DNA contaminatie
1.3.1.4 Polyacrylamide gelelektroforese
- Voor scheiden van DNA
- resolutie of oplossend vermogen → mogelijkheid om zeer kleine verschillen in lengte van elkaar
te onderscheiden (1 tot enkele nucleotiden)
- Handig voor zeer korte fragmenten
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 4
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur amberdams. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €14,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
73314 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans