Hoofdstuk 1: algemene inleiding
1. Doel van een biochemische analyse
Biochemie= de studie van chemische processen in levende organismen met als doel het
begrijpen van moleculaire werkingsmechanismen van de cel (de processen IN de cel worden
bekeken)
Bv. eigenschappen (structurele, kinetische en thermodynamische) van moleculen in
levende organismen, functie en mechanismen van moleculen waarmee ze andere
moleculen herkennen en er mee interageren, pathways verantwoordelijk voor
synthese en degradatie van moleculen, energetica van biologische processen,
genetische informatie en cel specificiteit
Proces:
1. Staalvoorbereiding
2. Zuivering en isolatie biocomponenten
3. Identificatie, karakterisatie en kwantificatie van de biocomponenten
In Vitro vs. In Vivo:
In Vitro: wordt eerst uitgevoerd (want is gemakkelijkste), is gemakkelijker te
interpreteren, de resultaten hiervan gaan we verder bestuderen met eventueel in
Vivo experimenten, hebben minder overeenkomsten met fysiologische situatie
In vivo: model organismen bv. gist, bacterie, muis, ratten …
2. Design van een biochemisch experiment (BELANGRIJK)
2.1 Cyclus lang:
Voorbeeld 1
Voorbeeld 2
Algemene design
1. Identificatie van het onderwerp
Anti-viraal middel tegen coronavirus
Eiwit dat zorgt voor borstkanker opsporen
2. Literatuur: kijken of er al studies gebeurd zijn, kijken
wat de sterktes/zwaktes van de reeds gebruikte
methodologieën en vooropgestelde hypotheses
Wat is er al gebeurd?, zijn er al studies uitgevoerd?
Kijken of er al eiwitten in het bloed gevonden die gecorreleerd zijn met borstkanker,
3. Vraagstelling of hypothese formuleren
Is het zo dat het extract toevoegen aan cellen zorgt voor een verlaagde virale productie
Kijken naar bepaalde klasse van eiwitten om meer kans op succes te hebben omdat uit
voorgaand onderzoek blijkt dat dit iets zou kunnen op leveren
4. Biologische systeem kiezen (species en in vitro/in vivo), ga je kiezen op basis van
beschikbaarheid en geld, je kan ook een cellijn kiezen (afkomstig van tumoren)
In vitro en species is humaan
Bloedstalen van patiënten die borstkanker hebben ontwikkeld (met verschillende graad)
1
,5. Identificatie van de variabele die bestudeerd gaat worden + de andere variabelen
moeten na gegaan worden, deze moeten constant blijven want alleen de geselecteerde
variabele mag de uitkomst van het experiment bepalen
Variabele is productie virus (wordt gemeten virus toe te voegen aan gezonde cellen en
mate van lyse zegt iets over de productie van het virus, kan ook met antilichamen
(fluorescent gelabelde antilichamen gaan we toevoegen en de variabele is dan dus de
fluorescentie) of met PCR (je meet hoeveelheid DNA van een bepaald stuk en dan weet
je hoeveel bepaalde sequenties aanwezig zijn)
Correlatie eiwit X met borstkanker, vrouwen die zware rookster zijn kunnen dan beter
niet worden geïncorporeerd in het experiment aangezien roken een variabele is die een
invloed kan hebben, dus je kan zeggen dat je bv alleen maar met stalen werkt van
vrouwen van 40 jaar, maar is wel heel specifiek, maar er moeten zo weinig mogelijk
variabele zijn
Als je veel variabele hebt, ga je moeten zorgen dat het aantal patiënten verhoogd
6. Design experiment, overweging materiaal en apparatuur en daaraan gekoppelde
veiligheid
We weten welke variabele we willen bestuderen, nu kijken welke materialen er nodig
zijn → kliniek contact voor afname stalen, stalen moeten worden ingevroren en
getransporteerd, moet terug worden ontdooid en zijn bloedstalen (ook kijken of je met
cellen gaat werken of met serum), als je met serum gaat werken heb je verschillende
technieken nodig om de eiwitten van elkaar te scheiden (chromatografie …)
7. Uitvoering experiment met de controles (controles moeten altijd worden uitgevoerd!)
en calbiraties (experimenten tov elkaar normaliseren, want als je bv vandaag en gisteren
iets doen kan het zijn dat bv je kolom gisteren anders was dan vandaag, moet dus
genormaliseerd worden)
Als controle geen virus toevoegen en zien of er dan fluorescentie is
Altijd + en – controle hebben!!, controle hier zijn gezonde personen (- controle, want je
wil eiwit hier niet tegen komen)
8. Analyse van resultaten (eventueel met statistiche testen)
9. Conclusies formuleren uit de resultaten
Fluorescentie daalt met een stijgende hoeveelheid extract
10. Nieuwe hypotheses en toekomstige experimenten formuleren die voortvloeien uit de
studie
Naar proefdieren gaan
Patiënten die al in een ver stadium zitten van tumor ontwikkelen zie je een eiwit, bij de
patiënten die een vroeg stadium hebben dit eiwit nog niet → nieuwe hypotheses en
toekomstige experimenten uit bedenken, dus terug naar beginnen bv. je doet hetzelfde
en eerste delen blijven hetzelfde, maar formulering van hypothese zou je kunnen zeggen
dat je niet naar het serum kijkt, maar naar bepaald type cellen in het bloed zoals
macrofagen en kijken of hierin een verandering is
2.2 Cyclus kort
1. Vraagstelling + motivatie: wat en waarom
2. Experimentele setup (inclusief controles)
3. Resultaten (grafieken, foto’s, tabellen)
4. Analyse+ statistiek
5. Bespreken van de meest opvallende zaken uit de resultaten
6. Conclusie
2
, 7. Verdere experimenten
2.3 Controles
Positieve controle → nagaan of het testsysteem werkt, kijken of alle componenten die we
gebruiken oke zijn, belangrijk wanneer resultaat negatief is
Negatieve controles → nagaan of resultaat louter en alleen het gevolg is van de test (bv. je
hebt een piek of een band door contaminatie), belangrijk wanneer resultaat positief is
Andere controles → bv. op parameters die moeilijk gelijk te houden zijn, vergelijking met
andere stalen, voor normalisatie (bv. met een zelfde experiment dat wordt uitgevoerd op
een ander tijdsstip)
3. Meeteenheden
4. Oplossingen: concentraties
Oplossing= homogeen mengsel van één of meerdere substanties (solutes) opgelost in een
vloeibaar component (solvent)
De concentraties van substanties in de oplossing geeft de hoeveelheid weer van elke
substantie in een bepaalde hoeveelheid (gewicht of volume) solvent:
Kan worden uitgedrukt in:
- Meestal gewicht/volume (w/v), soms ook v/v of w/w
- In percentage → v/v of w/w vermenigvuldigd met 100
o Bv. w/v: 1% NaCl oplossing= 1g NaCl in 100 cm³ of 100 ml water
- Ppm (…/106) of ppb (…/109) , kan gram per gram of cm³ zijn
o Bv. lucht bevat 8 ppm CO= 8cm³ CO per miljoen cm³ lucht
Bij water: 1g=1cm³
5. Oplossingen: het begrip molariteit
1 mol= de hoeveelheid van een substantie die 6,022 x 1023 moleculen bevat
Getal van Avogadro (Na)= 6,022 x 1023
3
, Moleculaire massa (MW)= aantal dalton (1 dalton is 1/12 van de massa van een 12C), som
van de atomaire massa’s
Relatieve moleculaire massa (Mr)= de moleculaire massa van een substantie relatief tot 1/12
van de atoommassa van 12C → dus MW= Mr alleen heeft Mr geen eenheid omdat die relatief
is
1 dm3 water= 1 kg water
!! 1 mol= de moleculaire massa (MW) (in gram) !!
SI voor concentratie → mol/m3, voor biochemische toepassingen: mol/dm3= mol/l water=
Molariteit M
SI moleculaire massa → Da (dalton)= g/mol
Moleculaire massa (MW) → som van de atomaire massa’s
Molariteit (M) → M= n/v
Verdunningen → M1.V1=M2.V2
5.1 Oefeningen
6. Electrolyten: ionaire concentratie of ionaire activiteit
6.1 Ionische sterkte
Ionisatie= uiteenvallen in ionen
Sterke electrolyten (stoffen die gemakkelijk ioniseren)
➢ Irreversibele ionisatie
➢ bv. Na en Cl in een kristal worden door ionaire binding bij
elkaar gehouden, gaan gemakkelijk uiteen vallen
Zwakke electrolyten
➢ Reversibele ionisatie
➢ Gaan niet helemaal uiteenvallen in + en – ionen, H2O kan
gemakkelijk worden afgesplitst
➢ bv. hydroxylgroep (OH): is covalente verbinding en H is partieel
positief (want sterk EN negatieve O), als de H wordt afgesplitst krijg
je een toestand zoals rechts boven onderste figuur en deze toestand
wordt verder gestabiliseerd doordat er een resonantie hybride kan
gevormd worden tussen rechts boven en rechts onder (dubbele
4
