2.3.1 RNA voorzorgen en bewaren
Problemen
- RNA profiel verandert na staalname
- RNA degradatie door endogene (in staal) of exogene (buitenaf) RNAsen
- DNA contaminatie (scheiding DNA en RNA meestal onvolledig)
Staalname
- Antistollingsmiddelen: EDTA, heparine inhibeert DNA/RNA reacties
- RNA stabilisatie: degradatie en/of inductie van RNA voorkomen adhv verwerken of invriezen in vloeibare stikstof, RNA bewaarmiddel toevoegen
°voor bloed bv: PAX gene tube
°voor cellen/weefsel bv: RNAlater, Trizol
Staalverwerking
- RNAse-vrij verwerken: RNAse inhibitoren zoals DEPC (reageert met amines in aminozuren in de katalytische site van RNAsen en inhibeert deze)
- Stalen beschermen: labojas, handschoenen, …
Bewaring
- RNAse-vrij water
- Kan 1 jaar op -80° (niet langer)
- Langer bewaren met alcoholpreciptaat
- Geheel staal bewaart beter dan enkel het RNA uit een staal
DNA contaminatie
- Veel contaminatie nodig vooraleer je dit zal detecteren
- Detectie: RTmin controle of elektroforese
- Verwijderen: DNAse behandeling adhv DNAsel (knipt DNA), inactivatie of verwijdering van DNAse na behandeling
- Nadeel DNAse verwijderen: verlies of degradatie van RNA mogelijk
, 2.3.2 RNA extraheren (= isoleren)
Algemeen RNA extractie met organische solventen Alchoholprecipitatie Kolomchromatografie
Stappen Trizol: component Guanidium Principe Principe
Lyseren Isoleren Oplossen thiocynaat -> cel lyse, RNAse inhibitor DNA/RNA vormt neerslag in - Silica kolom: buffer met
Lysis/ homogenisatie Stappen aanwezigheid van zout (natriumacetaat) chaotroop zout dat zorgt voor
- Toevoeging van remmers van Toevoegen mengen RNA en alcohol (ethanol, isopropanol). selectieve binding RNA aan
niet-gewenste moleculen gescheiden van DNA en eiwitten RNA Het lost terug op in water/buffer. kolom
- Reinigingsmiddelen = in waterlaag overbrengen naar nieuwe Wanneer - Bij bepaalde condities van het
detergenten tube alcoholprecipitatie of Bij lage concentraties op lagere zout en de pH: selectieve
- Vriezen, ontdooien kolomchromatografie van RNA uit temperaturen (-20°) binding van RNA
- Mechanische homogenisatie: waterlaag Of toevoegen van een drager - Bij andere condities wordt RNA
pletten tot poeder, vermalen Voordeel (glycogeen) terug vrijgezet (elutie)
met beads Eenvoudig, goedkoop, goede opbrengst Vergelijking met DNA Kolom
- Vloeibare homogenisatie: en zuiverheid Methode gelijk Vloeistof gaat erdoor op basis van
Dounce homogenisator, Vergelijking met DNA centrifugeren, zwaartekracht en vacuüm
Douncer, laat celfracties intact - DNA: phenol-chloroform <-> Voordeel verschillende types kolommen
- Sonicatie: geluidsgolven, RNA: Trizol Eenvoudig, zeer goede zuiverheid
nadeel: DNA/RNA fragmenteren - DNA scheiden in waterlaag of Nadeel verschillende types kolommen
organische laag <-> RNA Duurder, opbrengst beperkt door
scheiden in waterlaag capaciteit kolommetjes
- DNA en RNA: combinatie- Automatisering
methode Magnetische beads met silica
toevoegen, met een magneet kun je dan
beads uit oplossing halen
, 2.3.3 RNA kwantificeren (veel gelijkenissen met DNA)
Waarom?
- Inschatten opbrengst
- Toepassingen vragen bepaalde concentratie/ hoeveelheid RNA als input Te lage concentratie: onvoldoende input voor experiment, vooral bij weinig targets
Te hoge concentratie: inhibitie of saturatie, meer is niet altijd beter
Spectrofotometrie Fluorimetrie Elektroforese
Principe Principe Principe
Absorptie van licht door RNA in oplossing Fluorescentie vrijgezet door binden van fluorescente Scheiding van RNA moleculen op basis van grootte
Voordeel moleculen aan RNA Voordeel
Snel, eenvoudig, concentratie + zuiverheid Voordeel Concentratie, intactheid, lengte
Nadeel Selectiever voor RNA, nauwkeuriger, gevoeliger Nadeel
Aspecifiek, overschat concentratie, geen onderscheid Nadeel Agarose: enkel semikwantitatief en totaal RNA
DNA/RNA Duurder, omslachtiger, reagentia gevoelig aan Capillair: duur, speciale apparatuur nodig
Toepassing licht/temp Toepassing
Ng/ul range Toepassing Kwaliteitscontrole voor next-generation sequencing
Lage concentraties, hoge nauwkeurigheid
Werking Agarose elektroforese
RNA absorbeert UV licht van 260 nm, Wet van Werking -RNA migreert van – naar + pool volgens lengte
Lambert-Beer berekent hoeveel RNA Kleurstof met fluorescent molecule bindt selectief aan -Agarose gel kan denaturerende condities hebben
beeld van zuiverheid DNA of RNA en door de binding verhoogt de -Totaal RNA: 28S en 18S rRNA bandjes
A260/280: zuiver RNA = ongeveer 2 (1,8 bij DNA), bij fluorescentie -gDNA contaminatie als hoog-moleculair gewicht
eiwitcontaminatie is ratio lager bandje
A260/230: zuiver RNA = ongeveer 2, bij zouten en capillaire elektroforese
andere contaminanten is ratio lager kwantitatief
