Samenvatting (volledig + uitgewerkt) over het tweede deel van Analytische biochemie gegeven door Prof. Dr. Sebastiaan Eeltink. Deze samenvatting omvat volgende hoofdstukken: HPLC, GC, Resolving power to LC, Spectroscopie
SCHEIDING OP BASIS VAN VERDELING 1
ONTDEKKING VAN CHROMATOGRAFIE 2
GAS VS VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE 2
LAY-OUT VAN HPLC SYSTEEM 3
KOLOM TECHNOLOGIE 4
DETECTOREN 5
INVLOED OP RESOLUTIE 7
NORMAL PHASE (NPLC) 8
REVERSE PHASE (RPLC) 8
GRADIËNT ELUTIE LC 9
ION PAIRING AGENTS 11
ION-EXCHANGE CHROMATOGRAFIE (IEX) 11
SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAFIE (SEC) 13
CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS (CZE) 14
LAY-OUT CZE 14
ELEKTROMIGRATIE VAN IONEN 15
ELECTRO-OSMOTIC FLOW 15
ISO-ELECTRIC FOCUSING (IEF) 16
MICELLAR ELECTROKINETIC CHROMATOGRAFIE (MEKC) 17
HPLC-instrumentatie en scheidingsprincipes
= High pressure liquid chromatografie
= Vloeistofchromatografie
Scheiding op basis van verdeling
De scheiding van de componenten in een mengsel w gdn op basis van verschillen in
molecuuleigenschappen. Typisch op base van verdeling van analyten tussen de stationaire fase en de
mobiele fase.
De stationaire fase kan zowel vast, gelachtig als vloeibaar zijn (in dit laatste dan verspreid over een
vaste stof die niet meedoet aan het scheidingsproces) ® vaak silica.
De mobiele fase is vloeibaar bij HPLC en gasachtig bij GC.
Wat we zien is dat sommige analyten een hogere affiniteit tonen aan de stationaire fase, deze zullen dus
later elueren. Er heerst dus een verdelingsevenwicht tussen de stationaire en de mobiele fase.
Op het einde van de kolom heb je een detector. De detector reageert op de chemische eigenschappen
van je analyt en geeft het weer in een chromatogram. Bijvoorbeeld analyten met aromatiche structuren,
//… absorberen UV licht en kunnen we dus een UV detector aanleggen.
1
,Ontdekking van chromatografie
Mikhail Tswett was benieuwd naar kleuren van bladeren en voerde een scheidingsexperiment uit. Hij
had een gepakte kolom met carbonaatdeeltjes (stationaire fase) en goot er een sterk solvent door
(petroleum ether ® mobiele fase). Dit resulteerde in de scheiding van plantenpigmenten, aldus de
ontdekking van liquid chromatografie.
Gas vs vloeistofchromatografie
Meest gebruikte scheidingstechnieken zijn HPLC en GC:
-> GC gebruikt een gas als mobiele fase, dit door ofwel gebruik te maken van een gepakte kolom of
door holle capillaire kolommen te gebruiken.
o Sample moet klein en vluchtig zijn (bv aceton)
o Hoge scheidingspower
o Flame-ionisatie detector is praktisch perfect voor kwantificatie maaaar limitatie want deze detector
werkt bij zeer hoge T en is kan sommige analyten verwoesten (destructief ® niet het geval bij
HPLC).
o MS is praktisch perfect voor de identificatie (kan ook identificatie bij HPLC assisten)
o Vaak hebben GC kolommen een kleinere diameter en zijn ze langer.
Opstelling?
Cilinder met bv stikstofgas of waterstofgas. Kleppen om
gas af te sluiten.
Injectiepoort om staal te injecteren ® in capillaire
kolom.
In oven plaatsen om versch kookpunten te verkrijgen van
je moleculen en op basis van deze T kan je je molec
scheiden.
-> HPLC gebruikt dus een vloeibare mobiele fase om de analyten te transporteren. Hiermee kunnen we
de meeste biomoleculen scheiden.
o Selectiviteit gebeurt op basis van verdeling tussen mobiele fase en stationaire fase, ttz scheiding
gebeurt op basis van de affiniteit. De kolom is het hart van het systeem waardoor vloeistof door de
kolom w gepompt.
o Verschil in retentie moet zo groot mogelijk zijn zodat piekbreedte geminimaliseerd wordt.
o Gebeurt meestal bij kamertemperatuur.
o Vaak UV-detector. De flame ionization is meer universeel en meer gevoelig, maar de UV-detector
is niet destructief en semi gevoelig + kan ook een spectrum weergeven. Onthoud wel dat we voor
vluchtige kleine moleculen GC gaan gebruiken.
Waarom kunnen we zo weinig scheiden met GC (23%)?
GC kan zeer complexe (kleine) moleculen scheiden maar hierop staan vele limitaties, namelijk
door de vluchtigheid en de thermale stabiliteit (de moleculen moeten eerst in de gasfase terecht
komen).
2
,Lay-out van HPLC systeem
Pompen?
De pompen zijn zeer belangrijk bij HPLC. Hierin zitten pistons die door een sterke motor gecontroleerd
worden, op deze manier wordt er vloeistof (mobiele fase) door de kolom gepompt. We kunnen werken
met 2 soorten pompen:
o Reciproque piston pomp: minder efficiënt ® 1 piston ® geen continue flow rate
‘low pressure mixing’
Werking? Op de piston wordt er druk uitgeoefend ® mobiele fase zal zich verplaatsen naar de
kolom. Onderste balletje verstopt de doorgang voor vl en bovenste balletje kan ofwel links of naar
rechts gaan ® vl zal dus door 1 van deze onverstopte doorgangen naar de kolom stromen.
Natuurlijk moet de ruimte weer voorzien worden aan vl, dit door vacuüm. Vacuüm zal de balletjes
‘terugzuigen’ waardoor er ook vl vanonder w teruggezogen naar de ruimte.
o Duale piston pomp: efficiënter ® 2 pistons ® continue flow rate
‘high pressure mixing’
Werking? 1 piston pompt terwijl de andere de ruimte vult.
Voordeel? Makkelijk om een gradiënt profiel te maken door 2 pompblokken te
gebruiken (1 pompblok bevat 2 pistons). De ene kan dus water aanvoeren terwijl de
andere methanol kan aanvoeren.
3
, Ultra hoge druk?
Vloeistoffen persen met hele hoge druk ® vl w warm door de hoge energie die je er in steekt ® stel da
je begint met 1ml maar door de snelle samendrukheid eindig je met 0.8 ml ® dus er komt warmte vrij
en dit verandert de samendrukheid.
Oplossing? Snelheid van pistons zodanig regelen tijdens de gradiënt run + we gebruiken verschillende
grades van metalen, ttz verschillende soorten metalen in deze opstelling.
Injecteren van sample?
Na de pomp komt de injector:
o Handmatige injector: achter de stator heb je een rotor.In deze stator heb je 6 inlets
waarin je je staal injecteert (volledig injecteren tt stator vol zit), dees gaat door de rotor
in een groefje, draait en je staal komt terecht in de kolom. De pomp neemt de vl mee in
de richting van de kolom, ttz er heerst een constante flow rate.
o Automatische injector gebruikmakend van een ‘well-plate sampler’
Grote kans voor examen
Kolom technologie
Je kolom kan gepakt zijn met:
Welke kolommen zou je moeten kopen?
Kolommen met poreuze deeltjes hebben een groter opp, aldus kunnen
meerdere analyten hier aan plakken. Het heeft ook een nadeel, namelijk
difussie in en uit de poreuze deeltjes ® kost tijd.
Voorbeeld: Stel dat je een staal hebt met zeeer veel componenten, hiervoor
heb je een groter opp nodig, je gaat dus voor de poreuze beads.
Niet poreuze deeltjes zijn wel efficiënter.
Core shell deeltjes zijn buiten poreus en niet vanbinnen ® gehele difussie
dus niet mogelijk.
4
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur sarahvanvolsem. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €6,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
