Chromatografie
Papierchromatografie: de stoffen die goed hechten aan het papier (stationaire fase) worden
vertraagd. De stoffen die niet hechten lopen met het oplosmiddel (mobiele fase) mee.
Er bestaat stijgende, dalende en circulaire papierchromatografie.
Bij stijgende chromatografie laat je de loopvloeistof (eluens) in het papier stijgen. Het doorlopen van
het eluens heet elutie. De elutie gaat steeds langzamer
Bij dalende chromatografie loopt het eluens van boven naar beneden. De elutie verloopt steeds
sneller door de zwaartekracht.
Ontwikkelkamer; chromatografiebak deze zet je een tijdje van te voren klaar zodat de ruimte met
eluensdamp verzadig is dit heet conditioneren
na droging wordt de loopafstand bepaald. En de Rf (retardatiefactor)
a
Rf = = altijd >= 1
b
Rf = retardatie factor
a = loopafstand component (cm)
b = loopafstand eluensfront (cm) eind van loopvloeistof
door de Rf waarden te vergelijken kun je de componenten identificeren. De concentratie en
samenstelling van het monster heeft hier invloed op
Dunnelaagchromatografie (TLC/HPTLC); ipv papier een dunne laag van fijne cellulosekorrels op een
drager van kunststof of aluminiumfolie (TLC). (thin layer chromatography/ high performance) HPTLC
is een verbeterde uitvoering waarbij in kortere tijd nauwkeurigere resultaten worden behaald.
De stationaire fase is fijner verdeeld dan papier dus betere kwaliteit.
Behalve cellulose ook aluminiumoxide (alumina) en silicagel (silica) 90% van alle TLC. Sneller en
betere scheiding dan papier.
De stationaire fase
Startlijn geef je aan de rand aan. Monster breng je op met een dunne capillair langs een lineaal.
Als mobiele fase wordt een vloeistof toegepast die niet goed ‘loopt’ anders krijg je tijdens heb
opbrengen een circulaire chromatografie.
Bij HPTLC wordt speciale apparatuur gebruikt om het monster op te brengen tussen 0,05 en 1,0 ul
Elutie
Het eluens lost de componenten op en voert ze mee. De elutiesnelheid hangt af van:
- De oplosbaarheid van component
- De affiniteit van de component met de stationaire fase
- De affiniteit van het elutiemiddel met de stationaire fase
Hoe meer polair het is hoe sterker de elutie
De samenstelling van het eluens verandert tijdens het elueren. De meest polaire stof blijft achter en
de ander elueert verder. De lijn tot waar de polaire vloeistof komt heet het β-front.
Tweedimensionale elutie; eerst verticaal elueren dan een kwarslag draaien en horizontaal elueren.
, Omstandigheden die Rf waarde beïnvloeden:
- De opgebrachte hoeveelheid en vlekgrootte
- De dampsamenstelling in de ontwikkelkamer
- Scheiding van de mobiele fase tijdens de elutie
- Temperatuur
- Laagdikte van de stationaire fase
- Bindmiddel in de stationaire fase
- Verontreinigingen, door adsorptie tijdens het bewaren, in de stationaire fase
- Ionenconcentraties in het loopmiddel
- Zuurgraad van het loopmiddel
- Looprichting (stijgen, dalen, horizontaal
Om een component te identificeren is het nodig de referentiestoffen op dezelfde plaat als het
monster mee te elueren
Componenten zichtbaar maken;
1. De componenten zijn al zichtbaar
2. Door een fluorescentie-indicator, de plaat licht op onder een UV-lamp, de te detecteren
componenten zijn zichtbaar als donkere vlekken
3. Door een chemische reactie na het besproeien met reagens
TLC gaat vaak vooraf aan een instrumentele techniek, is eenvoudig, snel en goedkoop
Kolomchromatografie/vloeistofchromatografie; wordt uitgevoerd in een kolom, hierin zit de
stationaire fase.
Van het te scheiden mengsel wordt in 1x een volume toegevoegd. Tijdens de elutie worden de
componenten gescheiden en komen ze 1 voor 1 uit de kolom. Het eluaar vang je op in een reeks
opvangvaatjes (fractieverzamelaar)
De afremming van een stof door een kolom kan meerdere oorzaken hebben;
- Verdeling (oplosbaarheid) de componenten zijn verdeeld over de stationaire fase en de
mobiele fase. De component lost een beetje op in de
stationaire fase, lost hij weinig op dan komt hij sneller uit de
kolom
Cs
K=
Cm
K = verdelingscoëfficiënt
cs = concentratie component in de stationaire fase (mol/L)
cm = concentratie component in de mobiele fase (mol/L)
lost de component goed op K= groot
lost de component slecht op K= klein
- Adsorptie fysische of chemische aanhechting van de te
scheiden componenten aan de stationaire fase=vaste stof.
Aanhechting is meestal een kwestie van polariteit. Een apolaire stof zal op een apolair adsorbens
sterk vertraagd worden als het eluens polair genoeg is
Adsorptie is vaak een ongewenst bijverschijnsel en leidt tot tailing; er ontstaat een staart achter de
component van te sterk vertraagde componenten.
- Ionenwisseling geladen deeltjes geven scheiding door onderlinge aantrekking of afstoting
De stationaire fase = dragermateriaal met ionen.
Papierchromatografie: de stoffen die goed hechten aan het papier (stationaire fase) worden
vertraagd. De stoffen die niet hechten lopen met het oplosmiddel (mobiele fase) mee.
Er bestaat stijgende, dalende en circulaire papierchromatografie.
Bij stijgende chromatografie laat je de loopvloeistof (eluens) in het papier stijgen. Het doorlopen van
het eluens heet elutie. De elutie gaat steeds langzamer
Bij dalende chromatografie loopt het eluens van boven naar beneden. De elutie verloopt steeds
sneller door de zwaartekracht.
Ontwikkelkamer; chromatografiebak deze zet je een tijdje van te voren klaar zodat de ruimte met
eluensdamp verzadig is dit heet conditioneren
na droging wordt de loopafstand bepaald. En de Rf (retardatiefactor)
a
Rf = = altijd >= 1
b
Rf = retardatie factor
a = loopafstand component (cm)
b = loopafstand eluensfront (cm) eind van loopvloeistof
door de Rf waarden te vergelijken kun je de componenten identificeren. De concentratie en
samenstelling van het monster heeft hier invloed op
Dunnelaagchromatografie (TLC/HPTLC); ipv papier een dunne laag van fijne cellulosekorrels op een
drager van kunststof of aluminiumfolie (TLC). (thin layer chromatography/ high performance) HPTLC
is een verbeterde uitvoering waarbij in kortere tijd nauwkeurigere resultaten worden behaald.
De stationaire fase is fijner verdeeld dan papier dus betere kwaliteit.
Behalve cellulose ook aluminiumoxide (alumina) en silicagel (silica) 90% van alle TLC. Sneller en
betere scheiding dan papier.
De stationaire fase
Startlijn geef je aan de rand aan. Monster breng je op met een dunne capillair langs een lineaal.
Als mobiele fase wordt een vloeistof toegepast die niet goed ‘loopt’ anders krijg je tijdens heb
opbrengen een circulaire chromatografie.
Bij HPTLC wordt speciale apparatuur gebruikt om het monster op te brengen tussen 0,05 en 1,0 ul
Elutie
Het eluens lost de componenten op en voert ze mee. De elutiesnelheid hangt af van:
- De oplosbaarheid van component
- De affiniteit van de component met de stationaire fase
- De affiniteit van het elutiemiddel met de stationaire fase
Hoe meer polair het is hoe sterker de elutie
De samenstelling van het eluens verandert tijdens het elueren. De meest polaire stof blijft achter en
de ander elueert verder. De lijn tot waar de polaire vloeistof komt heet het β-front.
Tweedimensionale elutie; eerst verticaal elueren dan een kwarslag draaien en horizontaal elueren.
, Omstandigheden die Rf waarde beïnvloeden:
- De opgebrachte hoeveelheid en vlekgrootte
- De dampsamenstelling in de ontwikkelkamer
- Scheiding van de mobiele fase tijdens de elutie
- Temperatuur
- Laagdikte van de stationaire fase
- Bindmiddel in de stationaire fase
- Verontreinigingen, door adsorptie tijdens het bewaren, in de stationaire fase
- Ionenconcentraties in het loopmiddel
- Zuurgraad van het loopmiddel
- Looprichting (stijgen, dalen, horizontaal
Om een component te identificeren is het nodig de referentiestoffen op dezelfde plaat als het
monster mee te elueren
Componenten zichtbaar maken;
1. De componenten zijn al zichtbaar
2. Door een fluorescentie-indicator, de plaat licht op onder een UV-lamp, de te detecteren
componenten zijn zichtbaar als donkere vlekken
3. Door een chemische reactie na het besproeien met reagens
TLC gaat vaak vooraf aan een instrumentele techniek, is eenvoudig, snel en goedkoop
Kolomchromatografie/vloeistofchromatografie; wordt uitgevoerd in een kolom, hierin zit de
stationaire fase.
Van het te scheiden mengsel wordt in 1x een volume toegevoegd. Tijdens de elutie worden de
componenten gescheiden en komen ze 1 voor 1 uit de kolom. Het eluaar vang je op in een reeks
opvangvaatjes (fractieverzamelaar)
De afremming van een stof door een kolom kan meerdere oorzaken hebben;
- Verdeling (oplosbaarheid) de componenten zijn verdeeld over de stationaire fase en de
mobiele fase. De component lost een beetje op in de
stationaire fase, lost hij weinig op dan komt hij sneller uit de
kolom
Cs
K=
Cm
K = verdelingscoëfficiënt
cs = concentratie component in de stationaire fase (mol/L)
cm = concentratie component in de mobiele fase (mol/L)
lost de component goed op K= groot
lost de component slecht op K= klein
- Adsorptie fysische of chemische aanhechting van de te
scheiden componenten aan de stationaire fase=vaste stof.
Aanhechting is meestal een kwestie van polariteit. Een apolaire stof zal op een apolair adsorbens
sterk vertraagd worden als het eluens polair genoeg is
Adsorptie is vaak een ongewenst bijverschijnsel en leidt tot tailing; er ontstaat een staart achter de
component van te sterk vertraagde componenten.
- Ionenwisseling geladen deeltjes geven scheiding door onderlinge aantrekking of afstoting
De stationaire fase = dragermateriaal met ionen.
