samenvatting hoofdstuk 2 toolbox biotechnologie

Toolbox biotechnologie: Hoofdstuk 2
Gelelektroforese
Horizontale elektroforese
 DNA scheiding
 Gel = agarose
 Nancy, Redsafe (vroeger ethidiumbromide) of Diamond bindt specifiek aan DNA voor visualisatie

Verticale elektroforese
 Eiwitscheiding
 Gel = polyacrylamide
 Coomassie blauw bindt aspecifiek aan EW

Stappenplan: methode en principe
 Aanmaak buffer
 Aanmaak agarose gel
 Laden gel
 Elektroforese
 DNA visualisatie

Aanmaak buffer
 TBE of TAE = heeft 2-voudige beschermende functie
 Bestaat uit:
 Tris (base)
Zorgt ervoor dat pH behouden blijft en beschermd DNA tegen hydrolyse
 Boorzuur of Acetaat (zuur)
 EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) → blokkeert werking van DNase
 Deze buffer word gebruikt voor de aanmaak van de agarose gel

Aanmaak agarose
 Agarose = extract van zeewier
 moleculaire zeef = kleinere molecule DNA zullen sneller doorheen gel bewegen dan grotere
 1g agar (poeder) per 100 ml TBE (buffer) = 1% gel
 Agarosepercentages kunnen variëren van 0.3% agarose tot 4%
 Hoe kleiner het agarosepercentage hoe groter de te scheiden DNA grootte
 Poeder + buffer mengen en opwarmen tot kookpunt, daarna fluorescente dye toevoegen (Nancy)
 Handwarme oplossing uitgieten in mal + slotkam toevoegen die na uitharden verwijdert word

Laden gel
 Gel overbrengen in elektroforese toestel en aanvullen met TBE buffer tot gel volledig onder staat
 DNA stalen pipetteren in de slotjes = laden van de gel
 Laadbuffer/ loading dye word toegevoegd aan het DNA voor 2 redenen:
 Bevat kleurstof: om pipetteerproces en elektroforese makkelijker visueel te volgen
 bevat glycerol: maakt DNA oplossing zwaarder zodat deze makkelijk uitzakt in de slotjes
(densiteit van DNA oplossing wordt verhoogd)

Elektroforese
 40 tot 60 minuten op 70 – 100V
 Elektrisch veld ontstaat: - geladen DNA moleculen kunnen migreren richting positieve electrode
 DNA is negatief geladen en migreert van de kathode (-) naar de anode (+)
 Elektrocutiegevaar
 De afstand van migratie gebeurt in functie van de grootte van de moleculen
 Steeds visueel volgen
 Controle of elektroforese gestart is = vorming van bellen