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samenvatting celmobi: Hoofdstuk 9: DNA-analyse via restrictie en hybridisatie
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- Universiteit Gent (UGent)
samenvatting celmobi: Hoofdstuk 9: DNA-analyse via restrictie en hybridisatie
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Hoofdstuk 9: DNA-analyse via restrictie enhybridisatie
• Hybridisatie: een enkelstrengig stuk DNA, = probe, basenpaart met een complementair
stukje
Dit kan ook met RNA
→ Scheiding (denaturatie) v/d strengen in vitro met hitte of pH
→ Renaturatie bij lagere pH of temperatuur met toegevoegde probe
Hybridisatie
!!!! De probe is complementair aan de keten die opgespoord moet
worden → fluorescent merken
→ Naar gelang van stringentie (=condities: temp, pH) is de hybridisatie strenger of minder
Streng ⤷ Er is een perfecte match nodig
→ Gebruikt voor SNP-analyse
→ Via dot blot (druppels DNA of nylonmembraan)
→ Met DNA-chip (ASO op drager worden gehybridiseerd met DNA)
→ ASO’s = kunnen verschillende allelen onderscheiden
⤷ Allel-specifieke oligonucleotiden
→ De probe wordt in hoge concentratie toegevoegd => bindt eerst
• Restrictie-enzymen (endonucleases): herkent specifieke DNA-sequentie en knipt het DNA
=> restrictiefragmenten
→ Gelelektroforese: lengte bepalen
→ Herkenningssequenties: 4-6 basenpaarpalyndromen
→ Knipwijze: blunt (stomp) of sticky (overhangende) ends
⤷ ⤷
→ Enzymen vernoemd naar bacterie waaruit afkomstig
→ Pijl naar beneden om knipplaats aan te duiden (↓)
• Gelelektroforese:
▪ DNA: negatief geladen => migreert naar positieve pool
▪ Snelheid afhankelijk van grootte DNA-molecule
→ Agarosegel (100 basenparen – 20 kb)
→ Polyacrylamidegel (10 – 500 bp)
▪ Visualisatie door ethidiumbromide (oranje bij UV)
▪ Lengte van fragmenten door ladder met fragmenten met gekende grootte
• Southern analyse:
→ DNA-restrictiefragmenten gescheiden door gelelektroforese
→ Denaturatie (door pH)
→ Transferatie naar een membraan
→ Incubatie hybridisatiebuffer met gedenatureerde probe
→ Gebonden probe gevisualiseerd
• RFLP-analyse: Restrictie Fragment Lengte Polymorfisme
→ Verschil in lengte van restrictiefragmenten door verschil in DNA-sequentie
En zijn verschillende lengtes van restrictiefragmenten
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