Resume
RNA samenvatting
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
In dit hoofdstuk gaat het over RNA en al de methoden die hiervoor gebruikt worden zowel in bulk als single cell
[Montrer plus]
Aperçu du contenu
METHODEN: RNAZie methoden 1 voor verschillende methoden hoe RNA moet worden bereid voor deze verder te
kunnen gebruiken voor andere technieken.
RNA komt vooral enkelstrengig voor, terwijl DNA vooral enkel dubbelstrengig voorkomt, waardoor
RNA veel minder stabiel is dan DNA. RNAs bevatten ddNTPs en DNA bevatten dNTPs. RNA strengen
zijn in het algemeen veel korter dan DNA. RNA bevat een uracil in plaat van een thimidine.
Er zijn verschillende soorten RNA:
- DNA → RNA → eiwitten (mRNA, tRNA en rRNA nodig)
- Er is ook RNA dat niet omgezet wordt naar eiwitten (zowel lange als korte fragmenten)
o rRNAs en tRNAs helpen bij de translatie van eiwitten – zelf niet eiwit coderend
o miRNA → niet veel over gekend maar belangrijk bij gezondheid en ziekte
o piRNA = piwi-interacting RNA → interageert dus met piwi eiwitten → belangrijk bij
kiemcellen en dus bij de vruchtbaarheid
o siRNAs = small interfering RNA, short interfering RNA of silencing RNA → gebruikt als
methode voor het bestuderen van genexpressie
o lncRNAs = long noncoding RNA
o circulair RNA
▪ Belang van niet coderend RNA bij het gebruik van methoden
• Korter
• Geen poly-A-ataart
• In veel minder kopiën voorkomend in de cellen
• Aangepaste methoden nodig voor extractie en identificatie
Structuur van mRNA:
- De uiteinden van het mRNA liggen niet gecodeerd in het DNA, ze worden
toegevoegd/gemodificeerd
- 5’ cap = gemodificeerde G → methylgroep erop met een dubbele
fosfaatbrug
- 3’ poly A staart → een staart van een 50-250 tal A’s aan het uiteinde
- Pre-mRNA bestaat niet lang en is niet makkelijk te meten
Humaan genoom en transcriptoom
- ~20 000 genen
- ~200 000 transcripten
o Precieze aantal nog onzeker
o 50-100 000 proteïne conderend
o Veel niet coderend (lncRNA, miRNA…), pseudogenen
o Gen → vaak meedere transcripten door alternatieve splicing
Transcriptoomanalyse (transcriptomics)
Het doel van transcriptoom analyse = transcript(en) identificeren, genexpressie meten
- Targetgen(en() = te bepalen gen(en)/transcript(en)
- Bulk (=uit vele cellen samen) vs single cell (=individuele cellen)
1
, Er zijn verschillende methoden mogelijk:
1. Oudere methoden: Northern blot
o 1 gen – 1 transcript bepalen
o Duurt heel lang
o Bedoelt specifiek voor RNA
o Sample gaan laden in een gelleke en dan zo de lengte bepalen – deze dan overzetten
naar een papiertje en zo 1 gen bepalen voor 1 transcript
2. In situ (= op de plaats zelf) methoden (hybridizatie/PCR)
3. Kwantitiatieve PCR toepassingen (RT-PCR en ddPCR)
o Genexpressie kwantitatief
o Hoge throughput aantal stalen: 96-384 well PCR
o Enkele gekende transcripten in vele stalen
o Normale PCR = semi kwantitatief
▪ qPCR = de hoeveelheid van het staal
gaan bepalen en in real time
bepalen/bekijken
▪ dPCR = druppeltjes. In de druppeltjes elk apart een PCR reactie met probes
en primers voor al de verschillende transcripten
4. Micro-arrays
o Genexpressie kwantiatief
o Geel veel gekende transcripten, tot volledige transcriptoom
5. RNA-sequencing
o Genexpressie kwantiatief
o Heel veel transcripten, tot volledige transcriptoom
o Ook RNA sequentie aflezen, inclusief detectie ongekende transcripten
o Nu resolutie tot op niveau van individuele cellen
Transcriptomics : gaat over RNA analyse op grote schaal.
RNA (cDNA) micro-array
- Principe :
o RNA van staal wordt omgezet in gemerkt cDNA
o cDNA wordt gehybridiseerd met array die probes bevat voor verschillende (alle)
genen
o RNAs geëxprimeerd in staal geven een signaal op de array
o Miniaturiseerbaar → vele assays in parallel
- Nu: kant-en-klare-array
- cDNA microarrays
o probe = 1 labg cDNA molecule (600-2400 nt) of meerdere lange
oligonucleotides (70-80 nt) per gen (long-nucleotide microarray)
o probe gespot op vaste fase (microarray)
- high-density oligonucleotide microaarys:
o probe = meerdere korte oligonucleotides (~25-50 nt) per gen
o probe in situ aangemaakt op vaste fase (microarray)
o Eventueel controles:
▪ Match en mismatch probe
▪ Normalizatie-probes
▪ Replicatie-probes
2
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur saravanhecke23. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €3,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
67163 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans