In dit document zijn de lessen over het eerste deel van het moleculaire vak uitgewerkt. De lessen zijn in 2021 gegeven en de samenvatting is geschreven met de leerdoelen in het oog (ook in het document beschreven).
Les 1 & 2
AMPLIFICATIE TECHNIEKEN VOOR DETECTIE VAN MICRO-ORGANISMEN
- Heeft kennis en begrip van synthese, en structuur van nucleinezuren
- Kan de verschillende componenten van een PCR mix benoemen
- Herkent sense en anti-sense sequenties
- Kent de voorwaarden waar een primer/probe aan moeten voldoen
- Weet welke factoren van belang zijn bij het ontwerpen van primers/probes
- Begrijpt het principe van DNA bindende stoffen
- Begrijpt het principe van real time PCR
- Kent de relatie tussen het aantal cycli en de hoeveelheid DNA-amplimeren
AMPLIFICATIE TECHNIEKEN VOOR DETECTIE VAN MICRO-ORGANISMEN
- Kan een keuze maken voor een geschikt target voor een specifieke diagnostische real
time PCR
- Kan een DNA alignment analyseren en interpreteren voor het ontwerpen van primers
(m.b.v.bijv.Primer3)
- Kan het onderscheid benoemen voor moleculaire detectie van verschillende micro-
organismen (virussen, bacteriën)
- Kent de diverse typen controles en het gebruik er van (positieve, negatieve, interne
controles en endo-/exogenecontrole)
- Kan de detectiegrens, specificiteit en sensitiviteit berekenen
- Kan de data van een real time PCR reactie met gebruik van SYBR green en Taqman
probes te interpreteren
- Kan de uitkomst van een kwantitatieve PCR omrekenen naar de load van een
monster
Morfologie: hoe ziet bacterie onder microscoop uit
DNA
16s RNA
- Zit alleen in bacteriën
- Wordt gebruikt om bacteriën met elkaar te vergelijken (familie, geslacht ect.)
Gen
o Geconserveerde regio; bij elke soort zelfde, anders sterft soort uit
o Variabele regio; anders bij elke soort, kan soort aan herkent worden
Structuur DNA
o Dubbele helix met suikermolecuul, fosfaat groep en een
basen
o Waterstofbruggen verbinden baseparen
o Strengen tegenovergesteld & anti-parallel
,Basen
o Purine (A, G) bindt aan pyrimidine (T, C)
o Adenine bindt aan thymine met 2 waterstofbruggen
o Guanine bindt aan cytosine met 3 waterstofbruggen
PCR
Taq-DNA polymerase; snelle maar slordige polymerase, geen proofreading
- Handig bij herkenning virus
- Niet handig bij sequensing
Polymerase; twee strengen nodig om te binden
Primers
- 18-25 nucleotiden lang
- Hoog G-C gehalte (40-70%)
- Ongv. zelfde annealing temperatuur
- Geen baseparing tussen primer zelf of tussen twee primers (
- (mag niet omklappen, of forward & reverse binden
- Aplicon 75-200 bp. Hoogste efficiëntie
- Smelttemperatuur tussen 50 & 65 graden
Smelttemperatuur (Tm)
o Waar helft van DNA enkelstrengs is en andere helft dubbelstrengs
o Annealing temperatuur; iets onder Tm
Keuze gen & alignment
Primer
- Mag niet 100% gebonden zijn
- Mag losse 5’ kant hebben
- MAG NIET losse 3’ kant hebben
, Real time PCR
Lab vereisten
- Voor PCR detectie specifieke sequenties
- Specifieke technische handelingen, regenta & personeel
- Minimaal 3 verschillende ruimtes
Ruimte 1; maken master mixen, boven druk
Ruimte 2; ‘vieze lab’,toevoeging DNA aan mix ect.
Ruimte 3; PCR lab
‘Ruimte 4’; Aflees ruimte/ elektroforese
Voordelen
- Snelle werking; cycling times </=1,5 uur
- Hoge sample throughput (ongv. 200 monsters/dag)
- Heel gevoelig, in theorie; 1 dubbel strand DNA nodig om aan te tonen
- Detecteert kleinere verschillen tussen samples
- Grote dynamische range (10-10^10 copies)
- Reproduceerbaar
- Laag contaminatie risico
- Flexibele proefopzet
- Multiplex mogelijk (niet goed)
Meerdere targets 1 PCR
Theorie PCR
- Product = 2^n cycli
- Amplificatie; exponentieel, toename; gelimiteerd
- Real-time PCR geeft mogelijkheid om exponentiële fase te zien
> Met Ct kan je hoeveelheid start materiaal berekenen
Ct-waarde
o Cyclusnummer waar signaal boven
vastgestelde drempelwaarde komt
Drie methoden om test te kwantificeren
- DNA-bindende stoffen (SYBR-green,
EvaGreen, LC Green)
- Hydrolyserende probes (TaqMan,
Beacons)
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur momoya. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €4,48. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
