Resume
Samenvatting Moleculaire Biologie (GoO53C)
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
- Book
- Molecular Biology
Samenvatting van de belangrijkste informatie uit de lessen van Moleculaire biologie.
[Montrer plus]
Livre connecté
Titre de l’ouvrage:
Auteur(s):
- Édition:
- ISBN:
- Édition:
Aperçu du contenu
H1: De moleculaire aard vangenen
Geschiedenis
1. 1869: MIESCHER isoleerde nuclei uit etter vond fosforbevattende substantie (nucleine)
2. Einde van 19e eeuw: DNA en RNA gescheiden van proteïnen
3. 1910 – 1930: LEVENE karakteriseerde compositie van DNA/RNA: fosfaat + (deoxy)ribose
suiker + 4 verschillende bases
Belang van basensequentie nog niet ingezien
PROTEINEN, NIET DNA IS HET GENETISCH MATERIAAL
Tetranucleotide hypothese: fosforgroepen aan elkaar ipv aan de suiker
4. 1928: GRIFFITH deed aan bacteriële transformatie transformatie van component van
heat-killed virulente strain naar non-virulente strain
5. 1944: AVERY, MACLEOD & MCCARTY vinden dat het getransformeerde materiaal DNA is
geen virulentie meer na behandeling met DNase
DNA, NIET PROTEINE IS HET GENETISCH MATERIAAL
6. 1952: HERSHEY & CHASE vinden dat bacteriofaaginfectie van DNA komt gelabeld S-eiwit
komt niet in cel voor, maar gelabeld P-DNA komt voor in cel
7. 1953: WATSON & CRICK vinden dubbele helixstructuur van DNA
Chemische natuur van nucleïnezuren
Nucleoside= base + suiker
Nucleotide= base + suiker + fosfaatgroepen
FRANKLIN vond helixstructuur van DNA door X-stralendiffractie data liet repetitieve
structuur zien
WATSON & CRICK stelden structuur voor als dubbele helix met suiker-fosfaatruggengraat
aan de buitenkant en de bases aan de binnenkant
Tussen G en C: 3 H-bruggen vormen major groove (grote afstand tussen suikers)
Tussen A en T: 2 H-bruggen vormen minor groove (kleine afstand tussen suikers)
A-helix B-helix Z-helix
Draait rechts Draait rechts Draait links
In dsRNA Meest voorkomend Komt zelden voor
DNA-RNA Chromatine Poly(dGdC)
Nucleinezuur triple-helix
RNA-molecule met complementariteit aan dubbele DNA-helix laten binden (plaats genoeg in
grote groeve) geen Watson-Crick, wel Hoogsteen-basepairing
Kan in parallele en anti-parallele richting
Rol in chromatine organisatie, DNA repair, transcriptie regulatie en RNA processing
G-quadruplex
Spontaan gevormd als veel guanine-residues op DNA naast elkaar gelegen zijn + DNA-
polymerase haalt 2 strengen uit elkaar polymerasen raken erdoor geblokkeerd
1
,EIGENSCHAPPEN IN DNA
G/C en A/T verhoudingen zijn specifiek per organisme grote G/C verhouding in
organismen die leven in thermofiele bronnen (steviger aan elkaar)
Hoog G/C gehalte hoge smelttemperatuur
Hoog G/C gehalte hoge densiteit ( DNA scheiding door CsCl2 densiteit gradient
centrifugatie)
DNA kan gedenatureerd worden door organische solventen (DMSO, formamide), chaotrope
agentia (ureum; neutraliseert H-bruggen), hoge pH (NaOH) en lage zoutconcentratie
(ladingen stoten elkaar af en DNA denatureert)
Polynucleotideketen hybridizatie: samenvoegen van ssDNA en RNA northern blotting, S1
mapping, microarrays, FISH
DNA-grootte meten door elektronenmicroscopie en gelelektroforese
C-waarde paradox: de genoomgrootte staat los van de complexiteit van individu
Agarose Polyacrylamide
Horizontaal Verticaal
Lage resolutie Hoge resolutie
Natief DNA (niet) denaturerend
100 - >50.000 bp 1-1000 bp
Kleine fragmenten migreren sneller dan grote fragmenten
DNA renaturation (annealing)
Afkoelen complementaire strengen vinden elkaar terug (traag) ritssluiting (snel)
DNA kleiner maken door shearing (door sonicatie) grotere kans dat fragmenten hun
complement terug vinden
Bij lage zoutconcentratie + bij 20-25 °C
DNA sequencing (Dideoxy chain-termination
sequencing, Sanger)
1. Templatematrijs ssDNA nodig bindt aan primer die complementair is aan template
2. 4 DNA-bouwstenen en DNA polymerase toevoegen aan staal
3. Radioactief gelabeld ddATP toevoegen (ken geen nieuwe fosfodiesterbinding vormen
ketenterminatie)
4. Overmaat aan nucleotiden aanwezig toevallig ddATP ingebouwd polymerase stopt
5. Bij andere strengen gebeurt stop later/vroeger collectie fragmenten van verschillende
grootte die eindigen op A
6. Herhalen met ddTTP, ddCTP en ddGTP
7. Elektroforese: fragmenten scheiden met hoge resolutie
8. Bandjes visualiseren met kleurstof
9. Sequentie aflezen van onder naar boven
NU: capillaire elektroforese (800-1200 basen)
H2: Mechanisme van transcriptie
bij bacteriën
1. RNA polymerase structuur
Ionenuitwisselingschromatografie
2
, DEAE-cellulose kolom gebruikt voor opzuivering RNA polymerase
Oplossing eiwitten over kolom gestroomd - partikels blijven hangen, + gaat erdoor
- partikels elueren door ionische sterkte te verhogen
Scheiden volgens grootte met SDS-PAGE
A. RNA polymerase structuur ( Burgess, Travers 1969)
IEX van E. coli RNA polymerase SDS-PAGE van A, B en C pieken
Sigma: specificiteitsfactor + core: katalytische activiteit
B. Transcripti e-(a)symmetrie testen ( Bautz 1969)
Core enzyme transcribes both DNA
strands
Without sigma subunit: core enzyme has
basic transcribing ability, lacks specificity
2. Promotoren
C. Nitrocellulose fi lter-binding assay
Nitrocellulose bindt aan eiwitten, niet
aan ds DNA
DNA radioactief merken
1. Gemerkt ds DNA verschijnt in filtraat
2. Proteinen blijven aan nitrocellulosemembraan hangen
3. RNApolymerase blijft aan DNA hangen verschijnt niet in filtraat
D. Binden van RNA polymerase aan promotor ( Hinkle & Chamberlin 1972)
In vitro binding van gemerkt T7-DNA met holoenzyme/core
Overschot ongemerkt T7-DNA toevoegen
Nitrocellulosefilter-binding assay na verschillende periodes
Holoenzyme bindt DNA sterk
Core enzyme bindt meer kortstondig
E. Temperatuur en RNA polymerase binding
In vitro binding van gemerkt T7-DNA met holoenzyme en incubatie bij verschillende T
RNA polymerase bindt minder aan DNA bij lagere T
Hogere T promoten RNAP binding (door gemakkelijker DNA smelten)
RNA POLYMERASE/ PROMOTOR BINDING
1. Promotor search: holoenzyme bindt DNA eerst zwak en diffundeert langs DNA
2. Closed promotor complex formation (RPc): complex bindt zwak aan promotor (dsDNA in
gesloten vorm) lage affiniteit DNA
3. Open promotor complex formation (RPO): holoenzyme smelt DNA bij openen promotor
(polymerase wordt sterk gebonden)
FOOTPRINTING
1. DNA-fragment labelen met radioactieve P-groep
3
, 2. RNA-polymerase toevoegen
3. DNase toevoegen + eiwit verwijderen + DNA denatureren
4. Electroforesefragmenten van verschillende grootte electroforese
5. Bandenvrije zone: beschermd door eiwit Sanger
CORE PROMOTER ELEMENTS
A. -10 box (Pribnow box): TAtAaT
B. -35 box: TTGACa
C. UP element: in rRNA stimuleert transcriptie 30x
Promoter down mutations= mutations that weaken promoter binding increased
deviation from consensus sequence
Promoter up mutations= mutations that strengthen promoter binding less deviation
3. Transcriptie initiatie
F. Transcripti e initi ati e ( Carpousis 1980)
In vitro transcriptie van lacUV5 promotor in aanwezigheid gelabeld ATP denaturerende
PAGE autoradiografie
Polymerase begint aan promotor en gaat proefdraaien: produceert abortieve
transcripten
STAPPEN IN TRANSCRIPTIE INITIATIE:
1. Vorming closed promotor complex (RPc): losse binding
2. Omzetting naar open promotor complex (RPO): hechte binding
3. Polymerisatie eerste nucleotiden polymerase aan promotor (abortieve transcriptie)
4. Promotor clearance: transcript wordt lang genoeg om stabiele hybride te vormen met
templaat
Wanneer komt sigma los van complex?
G. Sigma sti muleert transcripti e initi ati e ( Travers & Burgess 1969)
In vitro transcriptie van T4 DNA door RNA polymerase core
Verschillende hoeveelheden σ
σ stimuleert initiatie en elongatie?
Elongatie lijdt tot meer C incorporatie
Rifampicine blockeert initiatie, niet elongatie
H. Reuse of sigma ( Travers & Burgess 1969)
In vitro transcriptie van T4 DNA door holoenzyme bij lage ionische sterkte (geen RNAP
dissociatie)
+ core (van Rif-resistant RNAP), +/- rifampicin
σ kan gerecycleerd worden voor initiatie
rifampicine blokkeert initiatie door met core te interageren
THE σ CYCLE MODEL
tijdens initiatie: σ kan gerecycleerd worden (σ-cyclus) core-enzyme laat σ los: dan
geassocieerd met ander core-enzyme
1. Obligate release model: σ dissocieert bij promotor clearance
4
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur freyavandeneynde16. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €6,49. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
Peut-on faire confiance à Stuvia ?
4.6 étoiles sur Google & Trustpilot (+1000 avis)
78252 résumés ont été vendus ces 30 derniers jours
Fondée en 2010, la référence pour acheter des résumés depuis déjà 14 ans