Samenvatting Histologie – 4sp
Hoofdstuk 1: Methoden en technieken in de cel- & weefselleer
1.1 Inleiding
1) Van cel tot weefsel
De basis functionele eenheid van weefsel is de cel. Cellen verschillen in grootte, vorm en
samenstelling. De structuur van de cel weerspiegelt haar functie. Vanuit de te verwachten functie van
een weefsel kan je dus ook de structuur van de cel afleiden: vorm volgt functie.
Om deze functie te kunnen uitvoeren worden individuele cellen georganiseerd in weefsels die op hun
beurt gecombineerd worden tot een functioneel orgaan. Organen worden dan op hun beurt
gecombineerd in orgaansystemen om uiteindelijk een functioneel, autonoom organisme te vormen.
De studie van de structuur van weefsels en cellen in hun normale omgeving van het weefsel wordt
histologie genoemd en is enkel microscopisch waarneembaar. De studie van de organen en structuren
die met het blote oog of macroscisch zichtbaar zijn behoren tot het veld van de anatomie.
Op het einde van de 17e eeuw, heeft Robert Hook voor het eerst cellen
beschreven. Het ging hier om een stukje weefsel van de kurk plant,
waarvoor hij de "lege ruimtes" beschreef als de cellen of kamers van
monniken. In dit weefsel waren de cellen uiteraard dood, maar dit heeft
wel voor het nodig inzicht gezorgd om dit verder uit te zoeken.
, 2) Verschillende microscopische technieken
Een microscoop is een instrument voor het bestuderen van objecten, die te klein zijn om goed met het
blote oog te kunnen worden gezien.
De lichtmicroscoop maakt voor de vergrootte afbeelding gebruik van zichtbaar licht. De objecten
worden bekeken ofwel met licht dat op het object zelf valt en weerkaatst wordt (met een
stereomicroscoop) ofwel met doorvallend licht (met een "gewone" microscoop met een of twee
oculairen en een objectief). De oculairen en objectieven zijn verwisselbaar voor andere vergrotingen.
Elektronenmicroscopie is een techniek die gebruikmaakt van een bundel elektronen om het oppervlak
of de inhoud van objecten af te beelden. Doordat versnelde elektronen een veel kleinere golflengte
hebben dan fotonen kan de resolutie van een elektronenmicroscoop veel hoger zijn. Er zijn 2 soorten
electronenmicroscopie die veel gebruikt worden: transmissie electronenmicroscopie en
raster/scanning electronenmicroscopie.
, 3) De resolutie van microscopie
De structuur van de cel en de weefsels en eventuele afwijkingen hierin kunnen macroscopisch (met
het blote oog) en microscopisch bestudeerd worden. Met een lichtmicroscoop kan je objecten nog
afzonderlijk herkennen tot een grootte van ± 0.2 μm (micrometer). De kleinste afstand tussen 2
elementen waarbij ze nog als afzonderlijke elementen kunnen worden geobserveerd noemt men de
resolutie. Voor elektronenmicroscopen kan deze gaan tot 0.1 nm (nanometer). Met een
elektronenmicroscoop neemt men de ultrastructuur waar van cellen.
Resolutie = de mogelijkheid van een optisch systeem om 2 nabijgelegen objecten nog afzonderlijk
weer te geven.
R = 0.61λNA
λ = golflengte van het ingestraalde licht
NA = numerieke apertuur (AN) = een dimensieloos getal dat aangeeft hoeveel licht een lens kan
opvangen (maw onder welke uiterste hoeken licht opgevangen of uitgestraald kan worden door deze
lens). Deze waarde vind je terug op elke lens in een microscoop en bepaalt in grote mate de resolutie
van de lens. De kracht van een lens ligt dus niet alleen in de vergroting (magnificatie) van een beeld,
maar ook in de kracht om elementen van elkaar te onderscheiden (resolutie).
4) Het gebruik van licht- & elektronenmicroscopie in de histologie
Afhankelijk van wat er precies moet gevisualiseerd worden zal de keuze moeten gemaakt worden
tussen licht- en elektronenmicroscopie.
Hiernaast zie je de
verschillende groottes
van structuren die
kunnen bestudeerd
worden door beide
technieken.
, 5) Anatomopathologie
Morfologisch onderzoek heeft naast een rol in het wetenschappelijk onderzoek ook een zeer
belangrijke rol in de kliniek. Dit laatste noemt men ook anatomopathologisch onderzoek. Doelstelling
van anatomopathologisch onderzoek is het geven van een diagnose (identificatie van de afwijking) en
van alle daarbij horende informatie waarop de aanvrager van het onderzoek verder zijn beleid voor de
behandeling van de patiënt kan bepalen. Basisvereiste voor anatomopathologisch onderzoek is een
goede kennis van de normale histologie en cytologie. Dit wordt zowel met licht- als met
elektronenmicroscopie gedaan.
Histologie = studie van de microscopische structuur van biologisch materiaal in weefselverband.
Cytologie = studie van losse cellen, niet meer in weefselverband.
1.2 Weefselcollectie voor histologie
Herkomst van weefsels en cellen:
- Operatieve of chirurgische wegname van organen/weefsels
- Biopsie (operationele wegname van een stukje weefsel uit het lichaam):
- Endoscopische biopsie = flexibele buis in het lichaam schuiven langs het
spijsverteringskanaal om zo een klein deel uit het slijmvlies weg te nemen
- Naaldbiopt = naald inbrengen in een bepaald (tumor)weefsel om een monster van
cellen of vloeistof af te nemen
- Excisie biopsie = (tumor)weefsel wordt volledig weggesneden samen met een rand
van omliggend gezond weefsel
- Punch biopsie = klein rond stukje weefsel (meestal huid) uitsteken
- Afzonderlijke cellen:
- Fijne naald aspiratie cytologie (FNAC) = met een dunne naald enkele cellen wegnemen
- Punctie = met een dunne holle naald worden cellen & vocht uit een orgaan gezogen
- Schraapsel
- Lichaamsvochten:
- Sputum = opgehoeste slijm dat vermengd is met speeksel en afkomstig is van
de diepere lichtwegen (luchtpijp, bronchi)
- Urine
- Bloed
,Materiaal geschikt maken voor beoordeling:
1.3 Lichtmicroscopie
1) Visualisatie van cellen in cultuur
Om (levende) individuele cellen te visualiseren zonder deze met een kleurstof te moeten aankleuren,
wordt gebruik gemaakt van "fase contrast" microscopie. Met normale microscopie zou het nl
onmogelijk zijn om enige structuur te zien.
Eigenschappen van fase contrast microscopie:
- Gehele object weergeven via
concentrische halos van donkere en
lichtere banden, t.g.v. minder of meer
verstrooiing van licht
- Minder gedetailleerd beeld
- Voor afzonderlijke cellen of dunne
cellagen
- Voor plaats en beweging van
organellen in levende cellen
, 2) Fluorescentiemicroscopie: principe
Bij fluorescentie microscopie wordt licht van een specifieke golflengte gebruikt om fluorescente
moleculen te laten oplichten die aanwezig zijn in cellen of weefsel.
Hierbij ligt de golflengte voor excitatie (het aanslaan van de fluorofoor) steeds lager dan deze van
emissie. Inderdaad, hoe lager de golflengte van licht, hoe meer energie erin vervat zit. Bij het
uitstralen van het licht gaat er steeds een beetje energie verloren (om de elektronen in een andere
schil te krijgen) waardoor de golflengte iets minder energetisch wordt. Zo wordt Fluoresceïne typisch
geëxciteerd bij 490nm en is de emissie te meten bij 520nm.
3) Fluorescentiemicroscopie: opbouw
De opbouw van een fluorescentie microscoop volgt de opbouw van een klassieke licht microscoop.
Echter, in plaats van wit licht te gebruiken wordt er een specifieke golflengte gebruikt. Dit wordt
geselecteerd aan de hand van een excitatiefilter, die enkel de juiste bandbreedte doorlaat (bv 480-
490nm om GFP te exciteren). Deze straal komt dan op het staal terecht, waar de fluorofoor wordt
aangeslagen en zelf op zijn beurt licht zal uitzenden. Om detectie mogelijk te maken wordt er gewerkt
met specifieke detectiefilters - bv een filter die enkel licht door laat van hoger dan 500nm zodat enkel
het uitgestraalde licht wordt gedetecteerd.
, 4) Confocale fluorescentie microscopie
Bij confocale laser fluorescentie microscopie wordt gebruik gemaakt van laser licht met een zeer
specifieke golflengte om zo, vergelijkbaar met 'gewone' fluorescentiemicroscopie specifieke
fluoroforen te laten oplichten. Het grote verschil is echter dat de golflengte van laserlicht dieper in het
weefsel kan doordringen wat bovendien ook nog eens zeer focaal kan worden gericht waardoor het
mogelijk wordt om 3D reconstructies te maken van cellen en weefsels. Hierdoor krijg je veel scherpere
beelden. Een nadeel van confocale microscopie is dat je het weefsel dus punt per punt moet
"scannen", iets dat veel tijd kost.
Er bestaan tegenwoordig al heel wat bijkomende confocale technologiën, waaronder twee-foton
confocale microscopie, spinning disc confocale microscopie, etc waarbij er gewerkt is aan een nog
betere en specifiekere excitatie van fluoroforen (bv enkel in het focale vlak adhv 2-foton technologie),
of er veel sneller kan worden gemeten (bv spinning disc microscopie).
, 5) Levende weefsels bestuderen
Om levende cellen of weefsels te bestuderen adhv fluorescentiemicroscopie, wordt er gebruik
gemaakt van fluorescente eiwitten - het bekendste is het "green fluorescent protein" of GFP.
Deze eiwitten kunnen specifiek tot expressie gebracht worden in bepaalde cellen van zowel
celculturen als in levende organismen zoals muizen, vliegen, vissen, kikkers, etc. Op deze manier kan
een bepaalde celtype of weefsel bestudeerd worden in zijn natuurlijke context. Het nadeel is natuurlijk
dat je een transgeen model moet aanmaken: voor cellen is dat vrij eenvoudig, maar voor organismen
vraagt dit de nodige inspanningen.
Daarnaast bestaan er tegenwoordig ook zogenaamde "levende cell"
kleurstoffen. Dit zijn kleurstoffen die aan het medium van cellen worden
toegediend, en enkel maar oplichten indien de cel een bepaalde
activiteit vertoont (bv Calcium signalering) of wanneer een cel begint af
te sterven (bv in een drug screen voor nieuwe kanker geneesmiddelen).
6) FACS: fluorescence assisted cell sorting
Fluorescence assisted cell sorting of kortweg FACS, is een methode waarbij:
1. losse cellen fluorescent gelabeled worden (dit kan via de expressie van GFP of aan de hand van
immunokleuring)
2. ze door een smalle buis worden gestuurd waar een laser zo wordt opgesteld dat voor elke cel die
langs komt, de fluorescentie kan gemeten worden.
3. wanneer elke cel in een grafiek wordt geplaatst (in het voorbeeld werden 2 merkers simultaan
gemeten in het groene en rode kanaal), kunnen verschillende celpopulaties worden gedetecteerd.
4. Een voordeel van deze methode is ook dat deze kan uitgevoerd worden op levende cellen: op deze
manier kunnen specifieke celpopulaties worden geisoleerd uit een grote groep cellen, en kunnen deze
cellen levend worden gecollecteerd, en verder opgegroeid en geanalyseerd.
, 7) Weefselpreparatie voor lichtmicroscopie
Om de cellulaire structuur van weefsel te beoordelen onder de lichtmicroscoop dient het weefsel een
aantal bewerkingen te doorlopen. Deze bewerkingen omvatten:
1. het bewaren en fixeren van weefsel
a. Invriezen
Enzym activiteit van eiwitten wordt vertraagd
b. Fixeren
Enzym wordt irreversibel geïnactiveerd
, 2. het vervaardigen van weefselsneden (coupes)
a. Versnijden & insluiten
b. Impregneren met paraffine
c. Gieten van de paraffine blok
