Moleculaire diagnostiek
Analysemethoden voor nucleïnezuren
Menselijk Genoomproject: 1990 – 2003
Vorderingen erfelijkheidsonderzoek:
- Eenvoudige stamboomanalyses → minuscule structuurveranderingen in chromosomen zichtbaar te maken
- Voor veel ziekten: verantwoordelijk gen + welke fout
Nieuwe behandelingen:
- Productie recombinante eiwitten voor therapie
- Gen- en stamceltherapie
Diagnosetechnieken
- Cytogenetische onderzoeksmethoden uitzicht chromosomen
- Moleculaire onderzoeksmethoden structuur aparte DNA moleculen
Karyotypering
- Meestal: perifere bloedmonocyten (PBMC)
- Ook: beenmerg, gekweekte huidfibroblasten, cellen van vruchtwater of chorion villi
Chorion = één van de membranen tussen foetus en moeder
- 5 – 10 ml heparine bloed
- Toevoeging van fytohemagglutinine → stimulatie celdeling T-lymfocyten
- Na 48-72h toevoeging colchicine: stopt celdeling in de metafase → chromosomen zichtbaar op evenaars vlak
Colchicine interfereert met de vorming van de spoeldraden
- Toevoegen hypotone oplossing: cellen zwellen en de individuele chromosomen worden gescheiden
- Fixeren
- Op microscoopglaasje + drogen
G-banding
Voor routine karyotypering wordt gebruik gemaakt van
Giemsa kleuring → G-banding: alternerende lichte en donkere
bandjes, karakteristiek voor ieder chromosomenpaar.
De donkere bandjes bevatten relatief weinig actieve genen,
zijn AT-rijk en repliceren laat in de S-fase. Lichte bandjes
bevatten ongeveer 80% van de actieve genen, waaronder alle
huishoudgenen, ze zijn relatief GC-rijk en repliceren vroeg in
de S-fase.
Een alternatief is de quinacrine kleuring die kan bekeken
worden onder UV-licht (Q-banding).
Moderne banding laat precieze identificatie van elk chromosoom toe en het ontbreken of bijkomen van DNA-
materiaal tot 4000kb. Betere resolutie of kleinere defecten opsporen is mogelijk met fluorescence in situ
hybridisation FISH, flow cytometrie of analyse van het DNA met array comparative genomic hybridisation aCGH (zie
verder).
Gecomputeriseerde systemen voor beeldvorming en geautomatiseerde karyotypering worden gebruikt in een
stijgend aantal diagnostische cytogenetische laboratoria.
,Flow karyotypering
Flow karyotypes van een normale man en een normale vrouw. De pieken komen overeen met individuele
chromosomenparen van groepen chromosomen.
Met behulp van een flow cytometer wordt de DNA-inhoud gemeten van individuele chromosomen, als deze in een
vloeistofstroom de laser passeren.
1. De chromosoomsuspensie wordt gekleurd met een fluorescente kleurstof, meestal ethidium bromide.
2. De fluorescentie die ontstaat door de laserstraal in elk chromosoom, wordt gemeten in een fotomultiplier en
geanalyseerd mbv een computer.
3. De resultaten worden voorgesteld in een histogram of flow karyotype, dat de chromosomen groepeert volgens
stijgende DNA-inhoud. Vele chromosomen vormen aparte pieken en het gemiddelde van elke piek is een maat
voor de relatieve DNA-inhoud van een bepaald chromosomenpaar. Het oppervlak onder elke piek stelt het
relatief aantal chromosomen voor in elke groep. Mannelijke en vrouwelijk flow karyotypes worden
onderscheiden door de grootte van de X-chromosoompiek, die bij vrouwen dubbel zo groot is als bij mannen.
De techniek kan gebruikt worden om variatie in individuele chromosomen na te gaan en voor de identificatie van
chromosoomafwijkingen, vooral voor microdeleties, omdat de resolutie 1-2 Mb is tov 4Mb voor de
lichtmicroscopische karyotypering.
Moleculaire onderzoeksmethoden
- DNA en RNA isolatie
- DNA detectie:
o Elektroforese
o Hybridisatie = het detecteren van DNA moleculen door gebruik te maken van DNA probes die gemerkt
zijn met labels
▪ DNA probes
▪ Detectie van de labels
▪ Stappen in het hybridisatieproces
▪ Hybridisatiemethoden
- DNA profielen
- Array-based Comparative Genome Hybridisation
- PCR en afgeleide technieken → volgend hoofdstuk
- DNA sequentiebepaling: de ultieme diagnostische tool
DNA en RNA isolatie
- mRNA’s: poly(A)-staart (= nodig om in cytoplasma te geraken) aan 3’ eind
- Isolatie via poly(T)-oligonucleotide ~ magnetische beads
- Rnase vrij werken! (bakken van het glaswerk, handschoenen dragen) en het gebruik van RNase-remmers
(diëthylpyrocarbonaat, RNnasin)
- DNA: denaturatie (= uit elkaar halen van de dubbelstreng) en extractie
- Detectie:
o UV absorptie bij 260 nm
o OD ratio 260nm/280nm → zuiverheid
Vb: wanneer je DNA uit bloedstaal gaat halen waarin ook EW zitten kan je via OD ratio gaan kijken hoe zuiver
je isolatie is geweest
o Fluorescerende DNA en RNA kleurstoffen: vb. EtBr, SYBR Green
,DNA isoleert men via denaturatie en extractie. → enige manier om DNA visueel te bekijken
Men gebruikt zouten om eiwitten te denatureren en
hoogmoleculaire nucleïnezuren in oplossing te houden.
Isolatie van DNA kan ook gebeuren door adsorptie op silicaatdeeltjes of filtratie over semi-
permeabele membraan waaraan DNA blijft plakken.
mRNA wordt geïsoleerd om het expressiepatroon van één
cel- of weefseltype te bestuderen (de volledige set mRNA
van 1 cel of 1 weefseltype = transcriptoom)
Gel-elektroforese
DNA- en RNA moleculen kunnen dmv gelelektroforese met een hoog oplossend vermogen worden gescheiden. Door
de negatief geladen fosfaatgroepen bewegen nucleïnezuren zich bij neutrale (basische) pH in een elektrisch veld
altijd naar de positieve pool.
De migratiesnelheid is afhankelijk van:
- Type gelmatrix
- Poriëngrootte
- Moleculaire afmetingen nucleïnezuur
- Conformatie nucleïnezuur
Men gebruikt agarose of polyacrylamide matrices.
Het polysacharide agarose wordt geïsoleerd uit zeewier. Hoe hoger de concentratie, hoe fijnmaziger het netwerk en
hoe moeilijker nucleïnezuren in de agarosegel kunnen migreren.
Polyacrylamide wordt direct voor gebruik gesynthetiseerd uit het monomeer acrylamide en het crosslinkende
monomeer bisacrylamide. De maaswijdte tussen de ketens, wordt bepaald door de hoeveelheid bisacrylamide.
, Ethidiumbromide
- Intercalatie duplex DNA
- Licht op bij UV licht
- Uiterst mutageen!
- Alternatief: SYBR Green
Exc: max bij 497 nm, emissie max bij
520 nm
Minder mutageen dan EtBr, maar
cytotoxisch, penetreert cellen (EtBr
niet).
Bovendien is het een intercalerende
kleurstof en dus mogelijk mutageen.
RNA gelelektroforese
RNA analyse door agarose gel elektroforese. De 28S en 18S rRNA
bandjes zijn zichtbaar.
- Lanen 1 en 2 zijn voorbeelden van intact RNA met een 28S:18S rRNA
ratio van ongeveer 2:1.
- Laan 3 is een voorbeeld van gedegradeerd RNA met een RNA smeer
onder de 28S en 18S rRNA bandjes.
- Laan 4 is een voorbeeld van RNA degradatie die resulteert in verlies van
de 28S rRNA band en een opstapeling van gedegradeerd RNA onderaan
de gel.
- Laan 5 is een voorbeeld van RNA met een aanzienlijke genomische DNA
(gDNA) contaminatie.
Polyacrylamide gelelektroforese
Betere resolutie of oplossend vermogen: mogelijkheid om zeer kleine
verschillen in grootte nog van elkaar te onderscheiden (1 tot enkele nt)
Handig voor zeer korte fragmenten
Hybridisatie
- Detectie van DNA of RNA target met probe
- Probe: ss (enkelstreng), gemerkt, complementair aan target
- In oplossing of op vaste drager of in cel- of weefselverband (FISH).
- FISH: Fluorescente In Situ Hybridisatie (hybridisatie ter plekken): op cellen of weefsels
- Hybridisatie: complementaire DNA/RNA-strengen vormen H-bruggen
- Smelten of denatureren: terug uit elkaar
Een probe = gemerkte, detecteerbare, complementaire nucleïnezuursequentie die ‘kleeft’ op het doelwit
(basenparing).
Hybridisatie = twee al dan niet volledig complementaire DNA/RNA strengen vormen basenparen.
Smelten/denatureren = breken van de H-bruggen die de twee strengen bij elkaar houden.
Analysemethoden voor nucleïnezuren
Menselijk Genoomproject: 1990 – 2003
Vorderingen erfelijkheidsonderzoek:
- Eenvoudige stamboomanalyses → minuscule structuurveranderingen in chromosomen zichtbaar te maken
- Voor veel ziekten: verantwoordelijk gen + welke fout
Nieuwe behandelingen:
- Productie recombinante eiwitten voor therapie
- Gen- en stamceltherapie
Diagnosetechnieken
- Cytogenetische onderzoeksmethoden uitzicht chromosomen
- Moleculaire onderzoeksmethoden structuur aparte DNA moleculen
Karyotypering
- Meestal: perifere bloedmonocyten (PBMC)
- Ook: beenmerg, gekweekte huidfibroblasten, cellen van vruchtwater of chorion villi
Chorion = één van de membranen tussen foetus en moeder
- 5 – 10 ml heparine bloed
- Toevoeging van fytohemagglutinine → stimulatie celdeling T-lymfocyten
- Na 48-72h toevoeging colchicine: stopt celdeling in de metafase → chromosomen zichtbaar op evenaars vlak
Colchicine interfereert met de vorming van de spoeldraden
- Toevoegen hypotone oplossing: cellen zwellen en de individuele chromosomen worden gescheiden
- Fixeren
- Op microscoopglaasje + drogen
G-banding
Voor routine karyotypering wordt gebruik gemaakt van
Giemsa kleuring → G-banding: alternerende lichte en donkere
bandjes, karakteristiek voor ieder chromosomenpaar.
De donkere bandjes bevatten relatief weinig actieve genen,
zijn AT-rijk en repliceren laat in de S-fase. Lichte bandjes
bevatten ongeveer 80% van de actieve genen, waaronder alle
huishoudgenen, ze zijn relatief GC-rijk en repliceren vroeg in
de S-fase.
Een alternatief is de quinacrine kleuring die kan bekeken
worden onder UV-licht (Q-banding).
Moderne banding laat precieze identificatie van elk chromosoom toe en het ontbreken of bijkomen van DNA-
materiaal tot 4000kb. Betere resolutie of kleinere defecten opsporen is mogelijk met fluorescence in situ
hybridisation FISH, flow cytometrie of analyse van het DNA met array comparative genomic hybridisation aCGH (zie
verder).
Gecomputeriseerde systemen voor beeldvorming en geautomatiseerde karyotypering worden gebruikt in een
stijgend aantal diagnostische cytogenetische laboratoria.
,Flow karyotypering
Flow karyotypes van een normale man en een normale vrouw. De pieken komen overeen met individuele
chromosomenparen van groepen chromosomen.
Met behulp van een flow cytometer wordt de DNA-inhoud gemeten van individuele chromosomen, als deze in een
vloeistofstroom de laser passeren.
1. De chromosoomsuspensie wordt gekleurd met een fluorescente kleurstof, meestal ethidium bromide.
2. De fluorescentie die ontstaat door de laserstraal in elk chromosoom, wordt gemeten in een fotomultiplier en
geanalyseerd mbv een computer.
3. De resultaten worden voorgesteld in een histogram of flow karyotype, dat de chromosomen groepeert volgens
stijgende DNA-inhoud. Vele chromosomen vormen aparte pieken en het gemiddelde van elke piek is een maat
voor de relatieve DNA-inhoud van een bepaald chromosomenpaar. Het oppervlak onder elke piek stelt het
relatief aantal chromosomen voor in elke groep. Mannelijke en vrouwelijk flow karyotypes worden
onderscheiden door de grootte van de X-chromosoompiek, die bij vrouwen dubbel zo groot is als bij mannen.
De techniek kan gebruikt worden om variatie in individuele chromosomen na te gaan en voor de identificatie van
chromosoomafwijkingen, vooral voor microdeleties, omdat de resolutie 1-2 Mb is tov 4Mb voor de
lichtmicroscopische karyotypering.
Moleculaire onderzoeksmethoden
- DNA en RNA isolatie
- DNA detectie:
o Elektroforese
o Hybridisatie = het detecteren van DNA moleculen door gebruik te maken van DNA probes die gemerkt
zijn met labels
▪ DNA probes
▪ Detectie van de labels
▪ Stappen in het hybridisatieproces
▪ Hybridisatiemethoden
- DNA profielen
- Array-based Comparative Genome Hybridisation
- PCR en afgeleide technieken → volgend hoofdstuk
- DNA sequentiebepaling: de ultieme diagnostische tool
DNA en RNA isolatie
- mRNA’s: poly(A)-staart (= nodig om in cytoplasma te geraken) aan 3’ eind
- Isolatie via poly(T)-oligonucleotide ~ magnetische beads
- Rnase vrij werken! (bakken van het glaswerk, handschoenen dragen) en het gebruik van RNase-remmers
(diëthylpyrocarbonaat, RNnasin)
- DNA: denaturatie (= uit elkaar halen van de dubbelstreng) en extractie
- Detectie:
o UV absorptie bij 260 nm
o OD ratio 260nm/280nm → zuiverheid
Vb: wanneer je DNA uit bloedstaal gaat halen waarin ook EW zitten kan je via OD ratio gaan kijken hoe zuiver
je isolatie is geweest
o Fluorescerende DNA en RNA kleurstoffen: vb. EtBr, SYBR Green
,DNA isoleert men via denaturatie en extractie. → enige manier om DNA visueel te bekijken
Men gebruikt zouten om eiwitten te denatureren en
hoogmoleculaire nucleïnezuren in oplossing te houden.
Isolatie van DNA kan ook gebeuren door adsorptie op silicaatdeeltjes of filtratie over semi-
permeabele membraan waaraan DNA blijft plakken.
mRNA wordt geïsoleerd om het expressiepatroon van één
cel- of weefseltype te bestuderen (de volledige set mRNA
van 1 cel of 1 weefseltype = transcriptoom)
Gel-elektroforese
DNA- en RNA moleculen kunnen dmv gelelektroforese met een hoog oplossend vermogen worden gescheiden. Door
de negatief geladen fosfaatgroepen bewegen nucleïnezuren zich bij neutrale (basische) pH in een elektrisch veld
altijd naar de positieve pool.
De migratiesnelheid is afhankelijk van:
- Type gelmatrix
- Poriëngrootte
- Moleculaire afmetingen nucleïnezuur
- Conformatie nucleïnezuur
Men gebruikt agarose of polyacrylamide matrices.
Het polysacharide agarose wordt geïsoleerd uit zeewier. Hoe hoger de concentratie, hoe fijnmaziger het netwerk en
hoe moeilijker nucleïnezuren in de agarosegel kunnen migreren.
Polyacrylamide wordt direct voor gebruik gesynthetiseerd uit het monomeer acrylamide en het crosslinkende
monomeer bisacrylamide. De maaswijdte tussen de ketens, wordt bepaald door de hoeveelheid bisacrylamide.
, Ethidiumbromide
- Intercalatie duplex DNA
- Licht op bij UV licht
- Uiterst mutageen!
- Alternatief: SYBR Green
Exc: max bij 497 nm, emissie max bij
520 nm
Minder mutageen dan EtBr, maar
cytotoxisch, penetreert cellen (EtBr
niet).
Bovendien is het een intercalerende
kleurstof en dus mogelijk mutageen.
RNA gelelektroforese
RNA analyse door agarose gel elektroforese. De 28S en 18S rRNA
bandjes zijn zichtbaar.
- Lanen 1 en 2 zijn voorbeelden van intact RNA met een 28S:18S rRNA
ratio van ongeveer 2:1.
- Laan 3 is een voorbeeld van gedegradeerd RNA met een RNA smeer
onder de 28S en 18S rRNA bandjes.
- Laan 4 is een voorbeeld van RNA degradatie die resulteert in verlies van
de 28S rRNA band en een opstapeling van gedegradeerd RNA onderaan
de gel.
- Laan 5 is een voorbeeld van RNA met een aanzienlijke genomische DNA
(gDNA) contaminatie.
Polyacrylamide gelelektroforese
Betere resolutie of oplossend vermogen: mogelijkheid om zeer kleine
verschillen in grootte nog van elkaar te onderscheiden (1 tot enkele nt)
Handig voor zeer korte fragmenten
Hybridisatie
- Detectie van DNA of RNA target met probe
- Probe: ss (enkelstreng), gemerkt, complementair aan target
- In oplossing of op vaste drager of in cel- of weefselverband (FISH).
- FISH: Fluorescente In Situ Hybridisatie (hybridisatie ter plekken): op cellen of weefsels
- Hybridisatie: complementaire DNA/RNA-strengen vormen H-bruggen
- Smelten of denatureren: terug uit elkaar
Een probe = gemerkte, detecteerbare, complementaire nucleïnezuursequentie die ‘kleeft’ op het doelwit
(basenparing).
Hybridisatie = twee al dan niet volledig complementaire DNA/RNA strengen vormen basenparen.
Smelten/denatureren = breken van de H-bruggen die de twee strengen bij elkaar houden.
