Samenvatting op basis van mijn notities en slides van de les. Voor de richtingen Biomedische Wetenschappen en Tandheelkunde, deze zien dezelfde leerstof in dit vak.
● Probleem bij lokalisering van genen in genoom = lengte chromosomen en
repetitiviteit van basen
○ Eerste oplossing ⇒ DNA fragmenteren door breken via niet-specifieke
endonucleasen of via sonicatie
■ Nadeel = willekeurige breuken
○ Uiteindelijke oplossing bleek uit onderzoek uit bacteriën ⇒ doen aan
transformatie = opnemen van DNA, met bepaalde restrictie (niet elk soort
DNA kan worden opgenomen) door endonucleasen
■ = restrictie-enzymen ⇒ herkennen ‘vreemd’ DNA en deze afbreken
■ Herkennen bepaalde palindromen van 4,6 tot 8 basenparen lang en
knippen in of in de omgeving van deze sequenties
● Doen dit adhv van hydrolysering van de fosfodiesterbinding in
de ruggengraat van de DNA keten
○ In het midden van het fragment ⇔ exonucleasen
● = restrictiesites
● Hoe bescherming eigen DNA tegen verknipping?
○ 2de enzym ⇒ voert methylaties uit van specifieke bases in de
herkenningssites ⇒ sequentie wordt niet meer herkend door
restrictie-enzymen
● Resultaat van knippen
○ Complexiteit genomisch DNA daalt
○ 1 gen wordt altijd op dezelfde manier geknipt
Terugvinden van een specifiek DNA fragment
● Denaturatie DNA
○ Uit elkaar halen van 2 complementaire strengen
○ Door H-bruggen te verbreken op een hoge temperatuur
● Hybridiseren DNA
○ Vormen van een dubbele helix
○ Radioactief/fluorescent merken van een streng vòòr hybridisatie om
complementair fragment te lokaliseren = probing
■ Wordt gebruikt in FISH
1
, Klonen van DNA fragmenten
● Plasmiden
○ Extrachromosomale circulaire minichromosomen bij bacteriën
○ Moet ORI bevatten ⇒ anders verloren bij snelle delingen van bacterie
○ Bevatten selectieve merker, bv. Gen
■ Codeert voor voordeel voor gastheer
■ Bevat dit geen merker dan verdwijnt plasmide zeer snel
■ Vaak kenmerken zoals resistentie
○ Kloneren = inbrengen van reeks restrictie-sites naast elkaar
■ = multiple cloning site/polylinker
■ Meerdere restrictoesfragmenten in eenzelfde plasmide kloneren
● Transformatie + kloneren
1. Plasmide (=vector) wordt met bepaald restrictie-enzym geknipt
2. Vermenging met fragment X (=insert), ook behandeld met hetzelfde enzym
3. Uiteinden hybridiseren want compatibel + DNA ligase verbindt
4. Voedingsbodem met DNA + bacteriën ⇒ transformatie van bacteriën
5. Bacteriën, bv. E. Coli, vermeerderen
6. Bij groot aantal bacteriën wordt plasmide opgezuiverd
● Nieuwe manier om te kloneren
○ Vector is onafhankelijk van de restrictieplaatsen
○ Gezuiverde enzymen doen aan homologe DNA recombinatie tussen uiteinden
plasmide en DNA-fragment
○ Plasmide is lineair en wordt samen met fragment bekomen adhv PCR
○ Sneller en efficiënter
Bepaling van een DNA sequentie
Enzymatische methode
1. Plasmide met insert, fragment dat men in sequentie wilt zetten, wordt
gedenatureerd
2. Hybridisatie met oligonucleotide dat complementair is aan een sequentie 5’ vh insert
3. Mengsel wordt verdeeld over 4 recipiënten met een specifiek type
dideoxynucleoside-trifosfaten (ddNTP)
- Bevatten geen 3’OH-groep ⇒ DNA synthese stopt hier
4. Oligonucleotide wordt gebruikt als primer door DNA-polymerase ⇒ opbouw van een
complementaire streng op basis van deoxyribonucleotiden (dNTP’s)
Voorbeeld ddATP
2
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur EmilieBMW. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €3,00. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
