HOOFDSTUK 1 - INLEIDING TOT DE PATHOLOGIE (LES 1)
DOELSTELLINGEN
1.1 DEFINITIE VAN ‘PATHOLOGIE’
Pathologie = leer der letsels (πάσχειν/ πάθος en λογος).
− Hij gaat deze definitie niet vragen op het examen, maar je moet het wel kennen.
Letsels ontstaan bij elke afwijking of onderbreking van de normale structuur (anatomie en
histologie) en functie (fysiologie) van cellen, weefsels, organen en volledige organismen →
Deze afwijkingen kunnen resulteren in ziekte met symptomen.
De pathogenese (het ontstaat van de letsels) is heel belangrijk voor de behandeling → je
moet dus in de kliniek terug stappen naar de letsels, omdat je juist die wilt behandelen. Als
je enkel naar het klinisch beeld kijkt, dan ga je symptomatisch behandelen, maar je pakt de
oorzaak niet aan.
1
,Vaak raak je niet tot aan de diagnose (omdat de eigenaar geen geld heeft). De pathologische
diagnose is de autopsie.
Etiologie (etiologisch agens) kan je indelen met 2 verschillende ezelsbruggetjes:
Idiopathisch = oorzaak onbekend
Iatrogeen = veroorzaakt door de
dierenarts
De etiologie kan ook een te veel aan zonlicht zijn (of te weinig). Het is niet altijd een MiO.
Noxe: iets schadelijks. Het ‘te’.
2
,1.2 SOORTEN PATHOLOGISCHE VERANDERINGEN
Er zijn 5 verschillende soorten pathologische veranderingen, waar de cursus ook grotendeels
is op gebaseerd:
1. Regressieve veranderingen: atrofie, degeneratie, necrose
2. Progressieve veranderingen: hyperplasie, hypertrofie, neoplasie
3. Regeneratie en reparatie
4. Circulatiestoornissen
5. Ontstekingen
1.3 SPECIALISATIES BINNEN DE PATHOLOGIE
Comparatieve pathologie: Studie van de pathogenese van ziekten bij verschillende species
→ nut van de veterinaire pathologie voor de mens (vb. mammatumoren bij de teef).
Diagnostische pathologie (zogenaamde diagnostiek): Weefselveranderingen gebruikt om
ziekte te karakteriseren.
− Lijkschouwing (postmortem macro + micro) (zie practicum 9 of 10)
− Biopsie name (in vivo macro + micro) (zie practicum 3)
Chirurgische pathologie: Biopsie als diagnosemiddel tijdens operatie.
Klinische pathologie: Labodiagnose van ziekte bij het levende dier → geavanceerde
onderzoekstechnieken, specialisatie in bepaalde organen of diersoorten.
Experimentele pathologie: Pathogenese op experimentele wijze in detail onderzocht.
3
,1.4 PATHOLOGISCHE ONDERZOEKSTECHNIEKEN
Term op examen, bv wat is transmissie-elektromicroscopie of immunohistochemie.
1.4.1 MACROSCOPIE
Visuele inspectie en palpatie = lijkschouwing = autopsie in strikte zin. Je
kan dit gebruiken voor de lokalisatie, distributie, kleur, grootte, vorm en
consistentie van letsels. Ervaring is belangrijk! Je moet letsels leren
herkennen en interpreteren.
Hier rechts zie je een hart met een hartbasis tumor thv het meetlatje.
Chemodectoma. Met puntbloedingen. Er loopt constant bloed in het
hartzakje, dit zet niet uit dus het ventrikel kan niet goed meer pompen.
= harttamponade.
1.4.2 HISTOLOGIE
Histopathologisch onderzoek met een lichtmicroscoop (LM) tot 1000x vergroot. Histologie is
de onvermijdelijke volgende stap na lijkschouwing.
De staal name en -verwerking tot gekleurde coupes duurt gemiddeld enkele dagen.
De staal moet op een weefselcassette passen en mag daarom niet te groot zijn. Hierna
worden er specifieke kleuringen gebruikt zoals: PAS-kleuring, Giemsa-kleuring, ijzerkleuring,
oil-red-o kleuring, Congo rood-kleuring, gram-kleuring, immunohistochemische kleuring.
Het staal moet gefixeerd worden. Dit kan bijv. in neutrale gebufferde 4% formaldehyde.
− Dit voorkomt autolyse en putrefactie (verrotting) veroorzaakt door spontaan
postmortaal vrijkomen van lysosomale verteringsenzymen.
− Het staal mag max. 1 cm lang, 1 cm breed en 0,5 cm dik want formaldehyde heeft
slechts een beperkt indringingsvermogen!
− Fixatie gebeurt door de vorming van methyleenbruggen in de eiwitten (er zitten veel
eiwitten in lysosomen, deze zorgden voor de autolyse, voor de zelfvertering na de
dood. De enzymen lekken uit in de omgeving,
zo vergaat het kadaver) bij
kamertemperatuur → wijziging tertiaire
structuur → enzymatische activiteit stopt,
doodt pathogenen (ontsmettingsmiddel!).
− Niet actief < 10°C → stalen niet in koelkast
plaatsen tijdens fixatie, minimaal 24 h
fixeren, langer indien grotere stalen +
insnijden. Niet te grote stalen nemen anders
dringt de formaldehyde te weinig in en is er
alsnog rotting binnenin.
− Ratio fixatief : staal = 10 : 1; wanneer er
eiwitoverschot bestaat treedt autolyse
alsnog op
4
, − Een oplossing van 37% formaldehyde in water = formol of formaline
• Zuiver formaldehyde is een poeder/vaste stof.
− Bufferen op pH 7,4 verhindert verzuring met verlies van fixerende capaciteit,
voorkomt vorming van mierenzuurkristallen en Hematine‐pigment op coupes. Je wilt
geen verzuring want dit geeft zwarte spikkels.
− Dit is een chemische fixatie, er bestaat ook een mechanische fixatie waarbij je het
invriest en een cryocoupe maakt.
Werkingsmechanisme van
formaldehydefixatie:
Hematine = formolpigment, ontstaat
wanneer RBC’s in contact komen met
zuur formaldehyde dat niet gebufferd is.
De RBC’s gaan hierdoor lyseren met
vrijstelling van hemoglobine. Hematine
moet onderscheiden worden van
haematoïdine en hemosiderine die wel
een pathologische betekenis hebben (zie
verder).
Formal is vaste stof, dit is max 40% van formaldehyde. 40% formaldehyde is formol.
10% formol = 4% formaldehyde.
De keuze van de staalnameplaats + de oriëntatie van het staal zijn cruciaal:
− Thv het gezonde weefsel?
− Thv de rand van het letsel?
− In het letsel zelf?
Je neemt een staal thv de rand van het letsel. Als je het
gezonde weefsel pakt, dan zie je niets bijzonders. Pak je het in
het letsel zelf, dan zie je enkel necrotisch weefsel. In het
centrum van een tumor zijn er geen bloedvaten dus er is
necrose, dus daar geen staal pakken.
1.4.3 HISTOCHEMIE
Histochemie is gebaseerd op chemische reacties
tussen de kleurstof en het weefsel waardoor bepaalde
chemische bestanddelen in weefsels specifiek
aankleuren.
Vb. Pruisischblauw om ijzerstapeling aan te tonen bij
hemochromatose of bij longstuwing (foto hiernaast).
Het ijzer is opgestapeld in de macrofagen in de
alveolen.
5
,1.4.4 ENZYMHISTOCHEMIE
Toont bepaalde enzymen in weefsels aan (omzetting van substraat door actieve
weefselenzymen tot gekleurd reactieproduct, bv. bruin). Omdat chemische fixatie (zoals
formaldehyde) de enzymen inactiveert moet thermische fixatie (vriescoupes) toegepast
worden → vriescoupes. Nooit met formol fixeren, omdat dan de eiwitten geïnactiveerd
worden en de enzymen hun functie verliezen.
1.4.5 IMMUNOHISTOCHEMIE
1.4.5.1 KLASSIEKE LICHTMICROSCOPISCHE TECHNIEK
Je gebruikt antistoffen waaraan er iets aan geplakt is. Datgeen dat eraan geplakt zit kan een
vloeistof dat je toevoegt aan de coupe een bepaalde kleur geven: bruin in dit geval. Als je
bruin ziet op de coupe weet je: daar heeft mijn antistof gepakt. Hij heeft zijn specifiek epitoop
gevonden en is er aan blijven plakken. Was de B-cel niet aanwezig had hij het epitoop niet
gevonden en was het weggespoeld onder de kraan. Zal dus niet bruin kleuren. Het is
natuurlijk een antistof tegenover een B-cel dus CD21, het moet kunnen matchen. Als er 2
antistoffen zijn: de eerste is de specifieke. Je kan een anti-von willebrand factor antistof
toevoegen, een specifieke primaire antistof en dit zal binden. De secundaire antistof kan
klikken op het Fc van de primaire, zal abundanter aanwezig zijn en meer kleuren. Je kunt
specifieke epitopen aanduiden met een antistof daar tegen gericht. Er is een kleuromslag bij
binding.
Bepaalde componenten (epitopen) in
weefselcoupes (vriescoupes of paraffinecoupes)
worden aangetoond met specifieke antistoffen.
Je kunt specifieke epitopen aantonen met een
specifieke antistof daar tegen gericht.
6
,Verkort voorbeeld van een immunohistochemisch protocol gebruikmakende van de
immunoperoxidase techniek:
− Staal gedurende max. 24h fixeren in formaldehyde om tertiaire structuur van
epitopen niet te beïnvloeden (hierbij is vaak antigen retrieval nodig)
− Histologische paraffinecoupes snijden. Alternatief kunnen cryocoupes gemaakt
worden zodat chemische fixatie vermeden wordt en de epitopen beter intact blijven.
− Aspecifieke bindingsplaatsen blokkeren met (geiten)serum.
− Coupes incuberen met primaire antistof.
− Coupes incuberen met secundaire antistof. Aan deze antistof zijn dikwijls meerdere
biotinemoleculen gebonden die de reactie zullen intensifiëren.
− Endogene peroxidases depleteren met H2O2. Anders zullen de peroxidases aanwezig
in bv. erythrocyten en macrofagen het in een volgende stap toe te voegen substraat
(bv. DAB = diaminobenzidine) oxideren met valse kleurneerslag tot gevolg.
− Streptavidine-HRP (horseradish = mierikswortel) peroxidase toevoegen als enzym
conjugaat.
− Streptavidine zal binden op de talrijke biotinemoleculen aanwezig op de secundaire
antistof.
De peroxidase zal het toegevoegde DAB dat in gereduceerde toestand kleurloos is oxideren
met vorming van bruine kleurneerslag thv. het epitoop.
Als je protocol gebruikt en je ziet bruine neerslag, dan is de epitoop aanwezig. Zie je geen
bruine neerslag, dan heeft de primaire antistof de epitoop niet gevonden.
Hiernaast zie je B-lymfocyten in de boviene temporale ln. Die
bruin worden aangekleurd → B-cel follikels zichtbaar.
Hematoxine wel gebruikt als kleuring voor rest van het
weefsel, anders zie je namelijk alleen maar die bollen.
Hematoxine in combi met eosine wordt minder vaak gedaan,
maar kan wel in combi met DAB.
1.4.5.2 IMMUNOFLUORESCENTIE
In plaats van Streptavidine-HRP wordt een fluorescerende stof aan de antistof gebonden. Na
excitatie met U.V. licht (via een kwikdamplamp of LEDs) wordt zichtbaar licht gereflecteerd.
Typische fluorescerende stoffen zijn FITC (fluoresceïne
isothiocyanaat = groen), TRITC (tetramethylrhodamine
isothiocyanaat = rood) en DAPI (4',6-diamidino-2-
phenylindole = blauw; zet zich vast op chromatine en wordt
aldus als kernkleuring gebruikt).
Voordelen: Dubbele en multipele kleuringen mogelijk.
Nadelen: lage gevoeligheid, andere structuren zijn niet
zichtbaar.
7
,Bij merged worden er verschillende foto’s over elkaar heen gelegd.
Je kan geen formaldehyde gebruiken voor de fixatie, omdat formaldehyde auto fluorescent
is en daardoor de hele coupe zal aangekleurd worden.
Er is emissielicht en excitatielicht.
1.4.5.3 IMMUNOGOUDLABELING
Bij immunogoudlabeling worden colloïdale goudpartikels
elektrostatisch gebonden aan antistoffen
Het wordt meestal gebruikt in combinatie met transmissie
elektronenmicroscopie (TEM) (zie verder).
Om de epitopen intact te houden maakt men cryocoupes → cryo-
TEM.
Hiernaast zie je goudbolletjes (zwarte bolletjes) die zijn
vastgehecht aan vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) in de
nier.
1.4.6 AANTONEN VAN SPECIFIEKE NUCLEÏNEZUURSEQUENTIES
1.4.6.1 TUNEL
TUNEL = terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end
labelling. Meerdere gelabelde deoxy-uridinetrifosfaat (dUTP)
moleculen worden aan de uiteinden van DNA-fragmenten
gehecht.
Bij apoptose zijn er veel fragmenten (doordat DNA geknipt is)
waardoor kleuring zichtbaar wordt.
Wanneer je wilt wilt of de cellen apoptose gaan plegen (bijvoorbeeld als je medicatie test
tegen een tumor, dan wil je dat dit gebeurd).
8
,1.4.7 SCANNING ELEKTRONENMICROSCOPIE SEM
Scanning elektronenmicroscopie (SEM) werkt als een super vergrootglas (tot x50.000)
waarmee het oppervlak van weefsel kan bestudeerd worden. Weefselstukjes die enkele
mm3 groot zijn worden beschoten met elektronen die terugkaatsen en opgevangen worden
door een detector. Grafiek niet kennen.
Elektronen worden afgeschoten van filament door hoge voltages
en worden geschoten op een beestje of stukje weefsel (dat je hebt
gecoat met goud of platina) dat de elektronen gaat reflecteren.
De microscoop maakt er een 3D beeld van.
Het is oppervlakkig, je kan er niet doorkijken.
1.4.8 TRANSMISSIE ELEKTRONENMICROSCOPIE TEM
Met deze methode kun je wel door het staal kijken. Het is een doorsnede van cellen.
Volgt het principe van de lichtmicroscopie, maar op veel sterkere vergrotingen (is ook het
verschil met scanning) (tot x200.000).
De lenzen zijn elektromagnetische lenzen. Het beeld wordt verkregen doordat elektronen
die door de coupes vliegen een fosforscherm doen oplichten. De coupes zijn slechts 60 nm
dik (normale LM gebruikt coupes van 6-8 micrometer dik).
Voor de rest is het systeem nogal analoog aan een SEM (want ook hier zit er een filament en
de elektronen passeren het staal en wordt het op een fosforplaat geprojecteerd).
Organellen, kern, microvilli zijn erg goed
zichtbaar.
Je kan zo bijv. het totale darmoppervlak van
een muis berekenen (1 m2) wat interessant is
om oral dose translations te maken.
9
, HOOFDSTUK 2 – STOFWISSELINGSSTOORNISSEN (LES 2-9)
LEERDOELEN
2.1 INLEIDING
2.1.1 DEFINITIES
Stofwisselingsstoornis = kwantitatieve afwijking in de biochemische processen van opbouw
en afbraak (omzetting van substraten). Niet in evenwicht van katabool en anabool.
− GEEN kwalitatief nieuwe omzettingen! (Anders neoplasie).
− De bestaande biochemische processen gaan onvolledig, in te geringe mate of in
overmaat, of op de verkeerde plaats door.
Opstapeling van substraat in bepaalde cellen of in het interstitium en/of het ontbreken van
bepaalde weefselbestanddelen (bijvoorbeeld een enzymdefect waarbij je geen glycogeen
kan omzetten tot glucose, glycogeen stapelt op, glycogenose: -ose is degeneratie) →
adaptatievermogen van de cellen is overschreden.
Reactie op endogene en exogene prikkels = adaptatie.
− Maar er zit een grens aan die fysiologische adaptatie mechanismen → dan ga je met
een degeneratie te maken krijgen = de veruiterlijking/letsels van de
stofwisselingstoornis. Dan zit je in de pathologie. Je kan daar nog steeds van
genezen! Het hoeft niet te leiden tot celdood.
Bijvoorbeeld een fout in de aanmaak van darmvili die elke 3/4 dagen vernieuwen. Als dit niet
goed verloopt zul je na 4 dagen incomplete darmvili hebben met als gevolg bijvoorbeeld
diarree. Kan ontstaan door een rotavirus. Of: verstoring in de apoptose waar dit wel de
bedoeling was: vingers aan elkaar, syndactylie.
10
