Alles Methoden 2 (2.1-2.8)
Methoden inleiding (2.1 & 2.2)
Studeren: begrijpen, vergelijken, grootorde van de getallen kennen (g vs mg)
In vitro, ex vivo, in vivo = wet lab
In silico = dry lab
Peer-revieuw = van collega OZ’ers
Laboschrift (gebonden) met controles, resultaten, …
Gedetailleerde beschrijving => republiceren door ander labo
Proefdiermodellen naar klinische studie
Weerlegd: andere resultaten in de mens dan model organisme
Gerepliceerd: positief: zelfde resultaten in mens
Dosis-respons curve: verschillende dosissen toedienen en zien wat er gebeurd
=> slaagkans klinische studie verbeterd
Replicatie: bij zoveel procent is na het opnieuw doen in de mens het juiste resultaat
Genetische evidentie bv. variant in gen zorgt voor ziekte
=> slaagkansen klinische studie verbeterd
Thalidomide: in proefdieren ging het wel: muizen-embryos hebben meer antioxidanten + beschermd
→ belangrijk verschil modelorganisme vs mens
Analyse = meten zoals het is
Modulatie = we gaan iets manipuleren/moduleren: behandelen, kloneren
Precisie:
Detectielimiet: vanaf deze hoeveelheid zie je dat er iets aanwezig is
Kwantificatie: vanaf deze hoeveelheid kan je het ook meten
Specificiteit bv. Coronatest alleen reageren op covid en niet andere antistoffen
,2.3 RNA
Inleiding
DNA vs RNA
- Thymine (stabieler) vs uracil
- Deoxyribose: Geen 2’OH vs ribose: 2’OH
=> 2’OH vatbaar voor afbraak door RNAsen
DUS DNA stabieler dan RNA => makkelijk modificaties
- Ds vs ss
- RNA kan secundaire/tertiaire structuur hebben + korter dan DNA
(ddNTPs bij Sanger sequencing => ook geen 3’OH => geen ketenverlenging (fosfodiesterbinding))
Soorten RNA
tRNA => TLN naar eiwitten I mRNA = boodschap voor TLN
rRNA (95%) => veel aanwezig DUS voor kwaliteitscontrole (zie verder) Coderend RNA
lncRNA = lang (>200 nt) I siRNA = kort => moduleren cellen
miRNA = kort (<200 nt) => reguleren TXN (genexpressie) Niet coderend RNA
mRNA
DNA → pre-mRNA → mRNA (matuur) → polypeptide
Splicing = verwijderen intrionen
TXN splicing TLN
Pre-MRNA (tijdelijk) = 5’cap + exonen + intrionen + polyAstaart
mRNA: 5’cap + 5’UTR + 3’UTR + polyA => niet naar eiwit
5’cap en polyA niet gecodeerd maar post-transcriptie toegevoegd
Voorzorgen en bewaren voor problemen
Modificatie RNA in staal (RNA instabiel <>DNA)
= Degradatie (dmv endogene/exogene bv.RNAse) + inductie genen
- Anticoagulans EDTA bij staalname <> heparine (inhibeert RNA reactie)
RNA stabilisatie => langer bewaren
snel werk, inviezen (vloeib. N2),
RNA bewaarmiddel => langer bewaren bij Tkamer
→ bij bloed (bv.PAXgene tube)/ bij cellen bv. Trizol (1e stap extractie) of
RNAlater (voor extractie): (NH₄)₂SO₄ -opl. => neerslag eiwitten (RNAse = eiwit)
RNAse vrij werk
labojas, handschoenen, RNAse schoonmaakproduct,
buffer/water bewerken met RNAse inhibitor => nuclease-vrij
bv. DEPC (carcinogeen): reactie amines van AZ in katalytic site(!niet in Trisbuffer: Tris= amine)
,Bewaring RNA
In RNAse vrij water/ TE buffer (EDTA inhib. enkel DNAsen), op -80°C (1jaar <DNA),
als alcoholprecipitaat,, meerdere aliquots in RNA bewaarmiddel => later RNA extractie
DNA contaminatie bij RNA extractie
(!moeilijker DNA verwijderen van RNA dan RNA van DNA)
- Niet altijd probleem
- Detectie via electroforese of RTmin controle
DNAse behandeling ALS contaminatie WANT ook verlies/degradatie RNA
= DNAse(l) tijdens/na extractie RNA => knip DNA + hitte inactivatie/ verwijderen DNAse
RNA extractie
! vgl met DNA extractie
1)Lysis van staal = kapot maken cellen
= breken cellen (RNA vrij) => °lysaat/ homogenaat = vl. met inhoud cellen (afh. startmateriaal en
doel)
- Toep. lyseren: In extractie van DNA (Hfdst 1.13), RNA (Hfdst 2.3), eiwitten (Hfdst 2.4)
Vaak toevoeging remmers van niet-gewenste moleculen, bv DNasen, RNAasen, proteasen,…
Methoden voor lysisch (afh. weefsel, celtype, V, …):
• Detergent toev. (meestal) bv. SDS, Trizol (guanidium thiocyanaat), guanidium chloride..=> lysis
• Vriezen en ontdooien (snel) => lyseren (kapot maken) cellen
( <> cryopreservatie (=traag) om cellen intact/leefbaar te houden: HT1.3)
• Mechanische homogenisatie:
o Pletten in mortier met pestel (in vloeibare stikstof)
o Bead-gebaseerde homogenisator:
beads (= kralen) in buis met cellen + schudden => °homogenaat
• Vloeibare homogenisatie: dounce homogenisator/ douncer:
oplossing tussen glazen pestels => bewegen => vloeistofstroom => lyseren cellen
Positief: milder: organellen intact (<> mechanische)
• Sonicatie (geluidsgolven) => OOK DNA/ RNA fragmenteren (bv. bij Sanger: DNA frag nodig)
, 2) Isoleren/extractie RNA
= RNA uit lysaat opzuiveren (geen eiwitten, DNA,…)
dmv organisch solvent, alcoholprecipitatie of
kolomchromatografie
Organisch solvent = Trizol = “in huis” protocol
= guanidium thiocyanaat (zuur: pH 4) – fenol – chloroform
∟ = detergent => cel lysis + RNAse inhibitor (=> RNA intact)
Werking: °organische- + inter- + waterlaag met RNA (boven) => overbrengen H20 laag tube
=> alcoholprecipitatie/ kolomchromatografie => isolatie RNA
+: makkelijk, goedkoop, goede oprengst
Vergelijk DNA: fenol – chloroform voor extractie DNA (pH=7 <> Trizol = zuur)
RNA (negatief Q: polair) altijd in H20 laag
<> DNA in H20 of organische/ interlaag afh. van pH (negatief Q/neutr.)
Alcoholprecipitatie supernatans (precipitatie = neerslag)
= idem DNA
DNA & RNA (P03-) neerslag bij toevoegen zout (bv Na+, Na-acetaat) + alcohol (ethanol, isopropanol)
=> Neg. DNA neutr. door Na+ (=hydrofoob)+ alcohol => neerslag uit opl. => °vlokje
(bij lage conc.: lagere temp. Of drager (glycogeen) toev. => beter zichtbaar)
=> RNA/DNA pellet oplossen in water/buffer
1e organisch/kolom => DNA/RNA dan precipitatie => neerslag DNA/RNA
→ DNA extractie: RNAsen toev => enkel DNA
→ RNA extractie (moeilijker) : 1e test of contaminatie DNA, 2e DNAsen (want RNA verlies)
Kolomchromatografie
1e RNA (/DNA) bindt selectief silica kolom dmv zout + pH condities => rest loopt door (!DNA niet
100%)
2e Elutie RNA door ∆condities
Opstelling: lysaat in kolom (silica/anionenuitwiss.) => vloeistof door kolom (dmv centrif., Fz of
vacuüm)
Pos: eenvoudig, zeer goede zuiverheid
Neg: duurder (aankopen), capaciteit kolom (kan maar beetje RNA binden)=> opbrengst beperkt
Silica kolom
= idem DNA <>bij DNA ook nog anionenuitwisselaar (+ Q)
• Buffer met chaotrope zouten (bv. quandidium Cl) (all-in one)
=> lysis, inhiberen nuclease, selectieve binding RNA aan silica kolom
• = Spin kolom: vloeistof door kolom dmv centrifugatie (eiwitten, .. verwijderen)
• Vrijzetten/ elutie RNA via water/buffer
Automatisering: voor grote schaal bv. Covid-19 test (RNA)
Magnetische silica beads => RNA/DNA bindt => magneet: beads uit opl. => ∆conditie => RNA vrij
Kwantificeren RNA
≈ DNA (onderlijn = verschil)
