Resume
Samenvatting methoden in biomedisch onderzoek hoofdstuk 11 elektroforese, western blot
- Établissement
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
ik was geslaagd voor alle vakken via mijn samenvattingen ;)
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Aperçu du contenu
Elektroforese en western bot (11)Methoden voor biomedische wetenschappen
Principe elektroforese
= scheiding van geladen deeltjes doorheen een gel onder invloed van elektrisch veld
Gelsystemen:
1. Agarose
└ Polysaccharide = polymeer van agarobiose
└ Niet-toxisch
└ Horizontale gels
└ Scheiding van nucleïnezuren
2. Polyacrylamide
└ Cross-linked polymeer van acrylamide
└ Neuro-toxisch (acrylamide)
└ Verticale gels
└ Scheiding van eiwitten
! Onder denaturerende condities of natief (3D structuur al dan niet bewaard)
Agarose gel elektroforese
1. Gieten agarose gel = poeder met buffer opwarmen + afkoelen in gelbalkje met kam
2. Staalvoorbereiding = laadbuffer toevoegen aan DNA/RNA
└ Kleurstof om staalmigratie te volgen
└ Glycerol om staal zwaarder te maken dan elektroforesebuffer
3. Gel lopen
4. Visualiseren DNA/RNA via bindende kleurstoffen fluorescent signaal
└ Ethidiumbromide geeft zichtbaar signaal onder UV licht
Toxisch en mutageen / carcinogeen
└ SYBRsafe geeft zichtbaar signaal onder blauw licht
Minder mutageen
Toepassingen:
- Nakijken lengte DNA fragment ladder als referentie
- Scheiden van DNA fragmenten voor opzuivering
- Nakijken integriteit / intactheid van RNA
, Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE)
SDS-PAGE = gedenatureerde eiwitten scheiden volgens massa / lengte
SDS toevoegen = ionisch detergent dat bindt aan aminozuren, zorgt voor
ontvouwen eiwit en geeft eiwit uniforme negatieve lading
Mercapto-ethanol , DTT of TCEP toevoegen = voor reductie disulfidebruggen
Opwarming tot 70°C
Stacking gel bovenaan de gel
└ Lager % polyacrylamide
└ Concentreren van staal voor het in scheidingsgel terecht komt
Betere resolutie scheiding en scherpere banden in scheidingsgel
Scheidingsgel onderaan de gel
└ Hoger % polyacrylamide
└ Scheiding van eiwitten volgens massa
Aankleuren van eiwitten
met Coomassie of zilverkleuring
Netto
ladin
Isoelectric focussing (IEF) = scheiding van eiwitten volgens isoelektrisch punt g
bij pH waarbij eiwit geen netto lading heeft
1) Aan lage/hoge pH hebben eiwitten een +/- lading
2) Migratie eiwitten door EV ladingen eiwitten veranderen door pH gradiënt
3) Als eiwit regio bereikt waar pH = pl stopt het migreren omdat het geen lading heeft
Toepassing: nakijken post-translationele modificaties
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