ZEER uitgebreide cursus die ik zelf heb opgesteld omdat ik nood had aan een ordelijke en uitgebreide cursus om methoden 3 te kunnen studeren.
In dit document staat de informatie vanop de slides gecombineerd met de mondelinge uitleg die werd gegeven tijdens de hoorcolleges.
, 1. Transcriptoomanalyse (transcriptomics)
1.1. RNA (cDNA) micro-arrays
RNA van staal wordt omgezet in gemerkt cDNA cDNA wordt gehybridiseerd met array die probes bevat
voor verschillende (alle) genen
cDNA microarrays: probe = 1 lang cDNA molecule (600-2400 nt) of meerdere lange oligont’s (70-
80nt) per gen (long-nucleotide microarray) probe gespot op vaste fase (microarray)
o synthese van probe door PCR, klonering of chemische synthese (daarna robotprinter
spotting van probes op microarray)
o verhouding test vs referentiestaal: verschillend fluorescent label; op 1 microarray (zie
verder bij “two-channel” detectie)
o voordelen: lange transcripten meten
o nadelen: veel input RNA nodig (<-> weinig abundante targets), probes niet altijd
enkelstrengs, cross-linken soms (niet handig om mee te werken)
high-density oligonucleotide microarrays: probe = meerdere korte oligont’s (25-50 nt) per gen.
probe in situ aangemaakt op vaste fase (microarray)
o evt controles: match en mismatch probe (1 nt verschil in midden dus gaat niet binden,
nuttig om achtergrond signaal te meten)
o andere soort probes die kunnen toegevoegd worden:
normalizatie-probes: normaliseren voor systemische bias, voor vergelijken van
microarrays, experimenten,… vgl referentiegenen (HK genes) bij RT-qPCR
corrigeren voor verschillende concentraties RNA in de inputhoeveelheid
replicatie-probes: technische herhalingen, voor reproduceerbaarheid
o synthese van probe op microarray zelf (bv fotolithografie) principe:
lokaal het beschermend laagje weggebrand
op die plaatsen wordt een bepaald nucleotide gebonden bv een T
een nieuw beschermend laagje wordt aangebracht
het proces wordt herhaald voor de andere nucleotiden en ook voor de volgende
baseposities
o reverse transcriptie: totaal RNA cDNA
o in vitro transcriptie: cDNA cRNA (biotine label eraan)
o Vervolgens fragmentatie, hybridizatie en detectie (“one-channel” detectie)
Ontwerp van de probes hangt af van wat je wilt meten: expressie op gen niveau (meerdere exonen),
expressie op exon niveau (hogere resolutie nodig om de exonen apart te bekijken) of expressie meten van
al dan niet alternatieve transcripten (gaat enkel het 3’ uiteinde van het gen meten zonder onderscheid te
maken tussen de transcripten
2 soorten detectie: fluorescentie:
“two-channel” = 2 kleuren (meteen te vergelijken)
o Test- en referentiestaal verschillend gelabeld; op 1 array. Verhouding (ratio) genexpressie
tussen test en referentiestaal (meestal Cy3 en Cy5 gebruikt)
o Voordeel: makkelijke vergelijking tss 2 stalen
o Nadeel: moeilijker voor meerdere stalen of om meerdere arrays te vergelijken
“one-channel” = 1 kleur (bv Affymetrix)
o 1 staal per array, fluorescentie intensiteit, absolutie genexpressie
o Voordeel: meerdere stalen en meerdere arrays vergelijken
Typische plots om te analyse op micro-arrays weer te geven:
Heatmap Vaak gecombineerd met een manier van clustering (dendrogram) = genen en/of stalen
groeperen supervised vs unsupervised clustering
Volcano plot: x-as is verschil in expressie (log2(fold change)) en y-as is stat. significantie
PCA = principal component analysis = a technique used to emphasize variation and bring out strong
patterns in a dataset often used to make data easy to explore and visualize
Classificatie van genen (Gene Ontology)
17
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur leenhaegemans. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €4,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
