Uitgebreide samenvatting Moleculaire Diagnostiek MNW jaar 2
23 vues 3 fois vendu
Cours
Moleculaire Diagnostiek (XB_42005)
Établissement
Vrije Universiteit Amsterdam (VU)
Uitgebreide samenvatting van Moleculaire Diagnostiek MNW jaar 2, gemaakt in 2022. Praktisch woord voor woord overgenomen uit de colleges, inclusief belangrijke vragen uit de werkcolleges die je kan zien als tentamen oefenvragen.
HC 1: 5 Sept
Docent eerste paar weken: Jesper Ruiter
Je volgt moleculaire diagnostiek (boek: immunoassay handbook. Maar je kan in principe dit
leren met alleen de ppt’s zegt docent)
en molecular imaging (boek: radiopharmaceutical chemistry).
17 okt vragenuur moleculaire diagnostiek
18 okt vragenuur molecular imaging
In ppt HC 1 staat schema met welke stof bij welke dag hoort.
Als je ziek bent stel je een diagnose: anamnese van de klachten en symptomen en metingen
doen. Metingen zijn:
-chemisch: in bloed, urine, weefsel biopt
-histologisch: cellen van weefsel
-beeldvormend: scan, röntgen, echo
60-70% van de medische beslissingen wordt genomen (mede) op basis van
laboratioriumonderzoek.
Biomarker is een stof die aangeeft dat je een bepaalde ziekte hebt.
Metingen t.b.v. diagnostiek:
-in monsters à ex vivo: meet concentraties van stoffen (biomarkers) in patiënt monsters.
-aan weefsel à ex vivo: histologie en cell imaging
-beeldvorming/imaging à in vivo / in situ: röntgen, CT, MRI, PET
Meten van stoffen in bloed of urine:
1. Monstervoorbewerking: verwijderen van storende componenten uit complexe
matrix
2. Scheiding met chromatografie: scheiden van de doelstof/biomarker (analiet) met de
overgebleven matrixcomponenten
3. Detectie: kwantitatief signaal van analiet detecteren om concentratie te bepalen
Beperkingen chromatografische analyse:
-Hetzelfde HPLC systeem is zelden geschikt voor meerdere analieten: reversed vs normal
phase chromatography bijv. (polaire vs apolaire stoffen).
-vereist vaak gedegen monstervoorbewerking
-sommige monsters/stoffen zijn lastig of niet te analyseren met chromatografie
-deze vorm van analyse duurt relatief lang ->
De factor tijd: gemm in ziekenhuis per jaar 1-3 miljoen klinisch-chemische analyses. Aantal
routinematig te bepalen stoffen (analieten/biomarkers) = 270. Tijdsduur chroma analyse = 15-
30 min zonder monstervoorbewerking. Dit betekent dat je 10.416 dagen bezig bent met
chromato analyse. Dan heb je 30 continu functionerende HPLC-systemen nodig.
Maar hetzelfde HPLC-systeem is zelden geschikt voor meerdere analieten, dus veel meer dan
30 systemen nodig. En resultaten zijn soms snel nodig, dus nog meer systemen nodig.
Kortom: chromatografie is geen high-throughput (HT) techniek!
,High-throughput analyse is bijv HT creatinine assay:
Creatinine is biomarker voor nierfalen als verhoogd in bloed en verlaagd in urine. Crea assay
voor bloedserum of verdunde urine:
Creatinine + picric acid (katalytische base) -> Janovsky complex
Incubatie 15-20 min. oplossing kleurt rood bij toenemende concentratie Janovsky:
lichtabsorptie bij 520 nm meten. Kan zo 300 creatinine-bepalingen doen in minder dan 1 u.
Referentiewaarden: man -> 80-125 micromol/L. vrouw -> 70-100 micromol/L
HT hardware zijn Compound Storage, Liquid Handling, Plate Readers, Labware en Robotic
Automation.
HT analyse is snel, maar vereist selectiviteit: om biomarkers te bepalen in complexe
biologische monsters zonder een vorm van scheiding (bijv, chromato) toe te passen, is
selectiviteit nodig. Voor lang niet alle relevante analieten die we willen bepalen is een
eenvoudige kleurreactie beschikbaar of gevoelig genoeg. Wat moet je dan doen? à
Gebruik selectieve interacties. Assays ontwikkelen die gebruik maken van zeer selectieve
biologische interacties. Zoals antilichamen die alleen aan bepaalde antigenen binden. Of
specifieke receptoren. Of enzymen.
Assay principe: in de moleculaire diagnostiek gebruik je label/tracer met bloed/samples, bij
molecular imaging label/tracer met mens.
Labeltype is afhankelijk van: de doelstof (specificiteit en interactie), detectiemogelijkheid
(technieken hiervoor, synthese stof, zuiverheid) en klinische toepassing (relevant gebruik).
Je gebruikt dus moleculaire interacties voor de diagnostiek!
Een antilichaam = een eiwit bestaande uit een aantal polypeptide ketens. Polypeptiden bestaan
uit aminozuren die onderling verbonden zijn door een amidebinding (O=N-H).
Een voorbeeld hiervan is lysozym: 129 AA’s, cysteïne aminozuren kunnen onderling
intramoleculaire disulfide bruggen vormen (-SH + -SH à -S-S-). Geeft structuur aan het
eiwit.
Een eiwit bestaat uit minimaal 50 AA’s.
Immunoglobuline G1 (IgG1) antilichaam: 2 zware ketens (onder en buitenkant Y-vorm) en 2
lichte ketens (binnenkanten Y-vorm). Zijn verbonden door zwavelbruggen. Heeft 2 antigeen
bindingsplaatsen. De lichte ketens zijn hypervariabel, bestaat uit loops waar antigen aan bindt.
Disulfide bindingen zorgen voor behoud van de structuur van IgG1.
IgG kan je glycosyleren: glycaan dat hieraan geconjungeerd is kan je dan aan de eiwitketen
zetten.
Je hebt verschillende typen antilichamen: meesten hebben een Y-vorm, maar IgM en IgA zijn
meerdere Y-vormen samen:
IgG’s zelf variëren onderling ook.
,Voor immunoassays worden bijna alleen IgG’s gebruikt omdat:
- IgG met de hoogste opbrengst geproduceerd wordt tijdens een immuunreactie (80%)
-IgG bindt met hogere affiniteit aan zijn epitoop
-IgG is stabiel tijdens isolatie en zuiveringsprocessen
-IgG heeft meerdere functionele gebieden die gebruikt kunnen worden voor chemische
koppeling
Functie antilichaam: schadelijke stof komt in het lichaam -> antilichaam ‘markeert’ dit (gaat
eraan zitten) -> immuuncellen vallen deze gemarkeerde stoffen aan.
De basisstructuur voor elk antilichaam is hetzelfde, maar de antigen-binding site is
verschillend. Antilichaam bindt sterk en zeer specifiek aan 1 bepaald antigeen: hoge
selectiviteit.
Het idee van een Ig assay: gebruik de zeer specifieke en sterke antilichaam antigeen interactie
voor de zeer selectieve bepaling van analieten (antigenen). Hiervoor heb je de productie van
analiet-specifieke antilichamen nodig. Maar de chemische synthese van antilichamen is te
lastig.
Biologisch immuunsystem bestaat uit je innate immunity (macrofagen, dendritische cellen,
basofielen etc) en je adaptive immunity (T-cel, B-cel met antilichamen, natural killer T-cel).
Immuunrespons: pathogeen komt lichaam in -> macrofaag adopteert hem -> presenteert
antigen -> T-lymfocyt receptor bindt aan antigen -> activatie Killer Cells en B-lymfocyten ->
B-lymfocyt ontwikkelt zich tot B geheugencellen en plasmacellen die specifieke antilichamen
produceren -> ontstaan antigen-antilichaam complexen -> macrofagen vreten dit op.
Dus B cellen produceren antilichamen tegen antigeen.
Immunogeen = een stimulus (groot molecuul, bacterie, virus etc) die een immuunrespons
veroorzaakt. Vaak groter dan 20kDa.
Antigeen = stof die specifiek kan binden aan een antilichaam
Epitoop = de specifieke site op een antigeen/immunogeen waar het antilichaam aan bindt
Hapteen = relatief klein molecuul dat specifiek bindt aan een antilichaam. Is wel een antigen,
maar geen immunogen. Dus bindt aan antilichaam maar veroorzaakt geen immuunrespons.
Voor de productie van specifieke antilichamen gebruiken we kunstmatige actieve immunisatie
(vaccinatie). Hierbij worden proefdieren gebruikt:
Injecteer antigen in proefdier -> antigen activeert B cellen -> plasma B cellen produceren
polyklonale antilichamen -> antiserum met de antilichamen uit het proefdier halen
(bloedprikken).
IgG productie:
Relevante analieten (je gewenste biomarker) zijn vaak kleine moleculen. Moleculen met een
molmassa < 2000 g/mol geven geen immuunrespons (=hapteen). In de klinische diagnostiek
zijn analieten vaak zo klein. Hoe maak je dan hiervoor antilichamen? à
Conjugeer het analiet eerst chemisch aan een groot molecuul (carrier molecuul) -> levert
Hapten-carrier conjugate -> immuunrespons.
, Productie van antilichamen 1): antigeen injecteren -> antigeen activeert B cellen -> plasma B
cellen produceren polyklonale antilichamen -> antiserum met antilichamen weer obtainen.
Productie antilichamen 2): affiniteitschromatografie à
-Antibody purification met protein A: ‘kraaltjes’ gecoat met protein A -> serum toevoegen ->
IgG bindt aan de protein A kraaltjes -> andere serum componenten worden ge-elueerd -> IgG
wordt van de kraaltjes af ge-elueerd met een zuuroplossing.
-Antigen-affinity purification: antigen-coated kraaltjes -> serum toevoegen -> specifieke
antilichamen binden aan de antigenen -> andere antigenen worden ge-elueerd -> antigen-
specifieke antilichamen worden ge-elueerd met een zuuroplossing.
Resultaat van immunisatie = een polyklonaal antiserum: een mengsel van verschillende
antilichamen met varierende specificiteiten, affiniteiten en/of epitopen. Mengsel van IgG
varianten (> 1000) voor 1 immunogeen. Heet ‘polyklonaal’. Een immunoassay kan op basis
van polyclonaal serum ontworpen worden.
Als je een homogeen antilichaam voor een immunoassay hebt noem je dat een monoclonaal
antilichaam (1 enkele IgG variant). Voor een zeer specifieke en reproduceerbare
immunoassay is het wenselijk om: altijd maar 1 en dezelfde variant antilichaam te kunnen
gebruiken, die bindt aan het antigen op 1 en dezelfde epitoop, met 1 en dezelfde affiniteit.
Productie van monoclonaal antilichaam (mAb):
B cellen uit de milt isoleren en kweken in het lab. Maar B cellen overleven niet geïsoleerd,
dus fuseren met meyloma cellen (kankercellen die dus oneindig vermenigvuldigen) tot
hybridoma cellen -> die produceren mAb en kunnen in cultuur worden gebracht.
Dus je krijgt een monoclonaal antilichaam producerende kankercel in cultuur.
Vervolgens screenen voor specifieke antilichaam producerende klones -> isoleer single clones
-> stop single clone in weefselcultuur medium tot leip veel deling -> opzuiveren mAb uit
medium. Nu mAb tegen antigen.
Bij polyclonaal verschillende IgG’s isoleren, bij monoclonaal 1 plasmacel isoleren en
opkweken.
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur lauraweerstra. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €6,99. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
